牛秀然
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
- 供职机构：南开大学医学院更多>>
- 发文基金：天津市自然科学基金国家重点实验室开放基金国家教育部博士点基金更多>>
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- 线粒体信号肽引导葡萄糖调节蛋白75-增强型绿色荧光蛋白(GRP75-EGFP)融合蛋白定位于线粒体被引量：2
- 2016年
- 目的构建葡萄糖调节蛋白75(GRP75)不同结构域、不同形式突变体与线粒体信号肽重组蛋白并鉴定其亚细胞定位。方法通过重叠延伸PCR,将线粒体靶向信号肽序列分别与GRP75不同结构域基因拼接。利用定点突变PCR分别扩增实现62和65位氨基酸突变的磷酸化失活型、磷酸化激活型突变体、482位氨基酸突变的底物结合缺陷型突变体及三位点同时突变重组体。将上述重组基因克隆入p EGFPC1真核表达质粒,酶切和测序验证后分别用脂质体转染He La细胞,Western blot法检测重组蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜观察比较重组蛋白亚细胞定位情况。结果成功构建了线粒体信号肽融合或缺失的GRP75结构域、磷酸化失活和激活突变体、底物结合缺陷突变体真核表达质粒。各重组质粒的片段插入、位点突变、信号肽融合情况均符合设计目的,在He La细胞表达后产物的相对分子质量大小均符合预期。EGFP蛋白C端插入信号肽能引导下游融合的GRP75全长蛋白、结构域片段、突变体蛋白表达定位于He La细胞线粒体中,而缺失信号肽的对应重组蛋白则主要分布于胞质和局部核周。结论构建了一系列GRP75重组真核表达质粒,EGFP融合信号肽能引导重组蛋白在线粒体中表达定位。
- 陈航牛秀然高嫒嫒张思河
- 关键词：重叠延伸PCR
- Dbl癌蛋白上调细胞巨胞饮促进TAT/DNA大分子药物内吞
- Tat类穿膜肽具有高效递送所携带生物大分子的潜能,但相关临床试验一直停滞不前。我们过去研究发现,Rho GTPases(如Cdc42 GTPase)激活可以促进TAT/DNA类大分子复合物的内吞。文献报道,Rho GTP...
- 齐珊珊高志慧牛秀然张思河
- 关键词：内吞大分子药物
- GRP75稳定onco-Dbl上调激活Cdc42促进非网格蛋白依赖性内吞
- Dbl癌基因家族在许多肿瘤发生发展中起着重要作用，其蛋白结构主要由DH及PH结构域构成.DH结构域有鸟苷酸交换因子(GEF)活性，而PH结构域影响其亚细胞定位.原癌蛋白proto-Dbl由于N端片段易与PH结构域结合呈现...
- 牛秀然高志慧齐珊珊张思河
- 关键词：GRP75内吞
