杨柳青
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 融合蛋白ScFv(3G11)-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定
- 2013年
- 目的构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a(+)质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5a中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a(+)-ScFv-mms13构建成功。SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0.2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a(+)-ScFvmms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。
- 邢秋翠孔登纪国强杨柳青王小柯崔楠
- 关键词：SCFV蛋白表达SDS-PAGEWESTERNBLOT
- 融合基因VH-mms13的构建及其蛋白表达鉴定
- 2015年
- 目的构建原核表达载体p ET30a(+)-VH-mms13,诱导表达后鉴定融合蛋白表达。方法分别扩增单克隆抗体基因的重链可变区VH基因和细菌磁小体膜蛋白基因mms13基因,采用重叠延伸PCR技术(splicing by overlap extension,SOE-PCR)构建融合基因VH-linker-mms13,并将融合基因插入pET30a(+)载体,酶切、测序验证;将重组质粒导入大肠杆菌DE3中,0.4 mmol/L异丙基疏代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳和Western blot双重鉴定。结果 PCR鉴定构建的融合基因VH-mms13大小为738 bp,与理论值相符,测序结果表明序列无误;转入DE3经IPTG诱导,在包含体中检测到融合蛋白表达;Western blot结果显示该表达蛋白可与His-tag抗体特异性结合,蛋白大小符合融合蛋白理论预期。结论成功构建了融合基因VH-mms13的表达载体p ET30a(+)-VH-mms13,且融合蛋白反应原性良好,为生物磁靶向药物的研发奠定了基础。
- 杨柳青孔登王雪耘王晓红孟丽王小柯
- 关键词：重叠延伸PCR融合蛋白
