包理忠
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
- 供职机构：西安交通大学医学院第二附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 髓磷脂相关抑制物66小分子干扰真核表达载体构建与筛选
- 2010年
- 目的构建并筛选出具有干扰作用的髓磷脂相关抑制物66(neurite outgrowth inhibitory 66,nogo66)小分子干扰RNA(samll interfering RNA,siRNA)真核表达载体,为进一步构建腺相关病毒载体奠定基础。方法设计2条针对大鼠nogo66基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)和1条阴性对照序列,插入载体pGenesil-1.1,同时用pGenesil-1.1质粒作为空白对照,得到4种质粒pGenesil-nogo66-siRNA-1、pGenesil-nogo66-siRNA-2、pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb,对4种质粒进行DNA测序和酶切鉴定;培养大鼠胶质细胞瘤C6细胞,用4种质粒进行转染,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白,检测转染效率;采用RT-PCR和Western blot分别检测nogo基因在mRNA水平和蛋白水平的表达差异,筛选出对nogo66基因具有干扰作用的nogo66-siRNA表达质粒。结果DNA测序显示设计的2种质粒干扰序列正确;KpnⅠ/XhoⅠ双酶切4种质粒均可见800bp及4.3kb条带;4种质粒分别转染C6细胞后培养48h,荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白表达,平均转染效率约为73%。RT-PCR和Western blot检测显示:与未转染细胞相比,转染pGenesil-nogo66-siRNA-1使nogo基因表达下降22%、蛋白表达下降73%,转染pGenesil-no-go66-siRNA-2使nogo基因表达下降28%、蛋白表达下降78%,差异均有统计学意义(P<0.05);而转染pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb后nogo基因表达和蛋白表达均无明显下降(P>0.05)。结论成功构建并筛选出具有干扰作用的nogo66-siRNA真核表达载体,为深入研究脊髓损伤修复奠定了理论基础。
- 李若飞党晓谦李建伟王坤正柏传毅包理忠娄高杰
- 关键词：真核表达脊髓损伤
