旨在探究不同FecB基因型对绵羊卵泡中BMP/SMAD通路活性和蛋白表达的影响;揭示成熟大卵泡和小卵泡之间BMP/SMAD通路活性和蛋白表达的差异。本研究采用TaqMan分型方法筛选出不同FecB基因型的母羊,同期发情后取卵泡期成熟卵泡和黄体期卵巢表面小卵泡,利用免疫印迹法(Western blot)测定BMP/SMAD通路相关蛋白表达水平和通路活性。结果表明,对于小卵泡组,FecB突变型卵泡中骨形态发生蛋白1B型受体(bone morphogenetic protein receptor type 1B,BMPR1B)表达量显著高于野生型卵泡(P<0.05),但SMAD家族成员4(SMAD family member 4,SMAD4)表达量和SMAD1/5/9的磷酸化水平显著低于野生型卵泡(P<0.05);对于成熟大卵泡组,FecB突变型卵泡中FKBP脯氨酰异构酶1A(FKBP prolyl isomerase 1A,FKBP1A)和SMAD4表达量显著低于野生型卵泡(P<0.05),Ⅰ型受体(BMPR1B)和Ⅱ型受体(BMPR2)的蛋白表达量及SMAD1/5/9的磷酸化水平在两种基因型之间未显示出显著差异。另一方面,对比FecB突变型小卵泡和成熟大卵泡发现:成熟大卵泡中BMPR1B和SMAD4蛋白表达量和SMAD1/5/9磷酸化程度显著高于小卵泡(P<0.05)。上述结果表明,由于SMAD4表达量的下降,FecB突变型大、小卵泡中结合到基因组靶区域的SMAD4-SMAD1/5/9蛋白复合物均相对较少,将导致通路活性降低,而且由于小卵泡中较低的SMAD1/5/9磷酸化水平,其通路活性更低。另外,绵羊突变型卵泡生长发育成熟后BMP/SMAD通路活性显著增强。
基于CRISPR-Cas系统的新型基因检测技术对核酸序列碱基突变检测分析具有独特的优势,但目前对单个碱基突变检测过程中的灵敏性和特异性研究较少。为此,本研究针对小尾寒羊中具有单碱基突变的多羔基因FecB进行研究,探究CRISPR-Cas系统对其检测的灵敏性和特异性。试验以小尾寒羊个体作为试验动物,提取基因组DNA,通过PCR扩增BB、++、B+型的基因序列为底物。基于Cas核酸酶的体外定点内切酶活性,针对FecB基因BB型基因序列设计了3种Cas9核酸酶sgRNA和1种Cas12a核酸酶crRNA,利用CRISPRCas9和CRISPR-Cas12a系统对不同基因型目标序列进行酶切检验,并探究Cas核酸酶的切割性能。结果表明:3种基因型的靶DNA均被切割为250 bp和100 bp 2个片段;Cas核酸酶切割性能检测结果显示,缩短酶切反应时间对提高Cas核酸酶切割特异性没有影响,降低Cas核酸酶和sgRNA浓度影响切割效率,但是不能有效改善Cas核酸酶的切割特异性,对区分FecB基因BB、++、B+基因型没有影响。本研究试验结果表明Cas核酸酶具有较高的切割稳定性和切割灵敏性,但其特异性是复杂的,受多种因素影响,且sgRNA/crRNA与靶DNA的互补配对有一定的容错性,存在单碱基错配不影响Cas核酸酶的切割活性,不能有效区分绵羊FecB基因型。本研究揭示了影响Cas核酸酶切割特异性的多重因素,为后续优化CRISPR-Cas系统中核酸酶和sgRNA/crRNA设计提供了理论基础,有助于提高基因组编辑的特异性和效率。
