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直接免疫荧光检测禽呼肠孤病毒方法的建立被引量：9: 2012年; 本研究利用经纯化的原核表达禽呼肠孤病毒(ARV)结构蛋白σ3作为免疫抗原,免疫兔子三次,血清效价达到27时采血分离血清。用硫酸铵沉淀法浓缩纯化血清中的IgG,纯化的IgG用荧光素FITC加以标记。利用制备的荧光标记特异性抗体和对反应条件进行优化,建立了表达σ3蛋白荧光抗体检测ARV的诊断方法。结果经纯化获得特异性抗ARV结构蛋白σ3的荧光标记IgG抗体。用标记的抗体检测ARV病毒感染的单层细胞,出现特异性的荧光。用建立的σ3-FA方法检测接种疑似ARV感染的病料的鸡胚原代成纤维细胞,检出的阳性样品与病毒分离结果一致。表明本研究建立的σ3-FA方法检测ARV病毒有较好的特异性,可用于ARV感染的临床样品检测。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基范晴; 关键词：禽呼肠孤病毒直接免疫荧光

禽呼肠孤病毒δNS和P17非结构蛋白作为ELISA鉴别诊断抗原的研究: 采用已构建好的PGEX-4T-1-δNS和PGEX-4T-1-P17质粒,原核表达了禽呼肠孤病毒(ARV)的两个非结构蛋白δNS和P17,将这两个蛋白进行包涵体纯化后作为包被用抗原,分别进行间接ELISA,并确定它们的最...; 谢芝勋秦春香谢丽基刘加波庞耀珊邓显文谢志勤; 关键词：禽呼肠孤病毒原核表达间接ELISA; 文献传递

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立被引量：20: 2007年; 为建立禽呼肠孤病毒（ARV）实时荧光定量RT-PCR检测方法，将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体，重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切，得到线性化转录模板DNA，将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板，用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物，以体外转录的RNA作为标准品，应用SYBRGreenI染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明，制作的标准曲线定量浓度范围宽，比常规的RT-PCR敏感1×10^3倍，可检测到5．2×10^2个拷贝的标准品RNA，与NDV、IBDV、MG均不反应；从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒，病毒含量为1×10^5～1×10^7个拷贝／μL.表明，建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于ARV的检测。; 童桂香谢芝勋黄琦文艳玲谢丽基庞耀珊刘加波邓显文; 关键词：禽呼肠孤病毒体外转录 SYBR 荧光定量RT-PCR

禽呼肠孤病毒σ3蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定被引量：3: 2013年; 用体外表达的蛋白作为免疫原来制备特异的单克隆抗体,并对制备的抗体进行鉴定。将ARVσ3蛋白基因在体外扩增,扩增产物与载体PGEX-4T-1连接并在基因工程菌中表达,体外表达的蛋白经纯化后作为免疫原来制备特异的单克隆抗体和ELISA检测包被抗原,测定纯化后蛋白的浓度,按每鼠100μg的蛋白用量免疫BALB/c小鼠,免疫4次后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1进行融合。对融合后的杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,通过间接E-LISA方法测定其抗体效价,并通过Western Blot、Dot-ELISA、直接免疫荧光、病毒中和等方法对获得的单抗特性进行检测。结果通过纯化的病毒含量为41.5 mg/mL,应用纯化的病毒免疫BALB/c小鼠后与骨髓瘤细胞融合,通过克隆筛选成功获得1株能稳定传代并分泌抗禽呼肠孤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株σ3 B6-3 K3,用其制备的腹水经间接E-LISA测定效价达105以上,并且与其他参试病毒株没有交叉反应,具有良好的特异性;病毒中和试验证明其中和能力低。应用ARVσ3蛋白制备并获得的杂交瘤细胞株σ3 B6-3 K3具有很好的特异性,不具有中和ARV的关键表位,可以用于ARV的特异性检测。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基范晴; 关键词：禽呼肠孤病毒单克隆抗体

禽呼肠孤病毒S1733株单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立被引量：7: 2013年; 将禽呼肠孤病毒(ARV)S1733株进行鸡胚增殖,增殖的病毒经浓缩、纯化后灭活,按每鼠100μg的病毒用量免疫BALB/c小鼠5次,每次间隔7 d,第五次免疫3 d后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合及筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,用克隆的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。抗体经Western blotting、Dot-ELISA、直接免疫荧光等方法进行检测验证。经验证的的单克隆抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA方法检测ARV。对建立的方法进行特异性和敏感性试验。结果:筛选成功获得1株能稳定分泌抗ARV的单克隆抗体杂交瘤细胞株SF6-3 K3;免疫荧光和Dot-ELISA方法证明该单克隆抗体能特异性地检测ARV;间接ELISA方法测定腹水单克隆抗体效价达105以上,经亚型测定为IgG1,并且具有良好的特异性;用单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA方法特异性强,与对照的毒株新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)无交叉反应,检测的敏感性为5×10-5μg/μL的病毒量。结果表明,本试验建立的夹心ELISA检测ARV方法具有较高的特异性和敏感性,可以用于ARV的检测。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基范晴; 关键词：单克隆抗体夹心ELISA

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立: 为建立禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,SalⅠ单酶切得到线性化转录模板DNA,体外转录出RNA,梯度稀释作为阳性模板,用于标准曲线的制定...; 童桂香谢芝勋黄琦文艳玲谢丽基庞耀珊刘加波邓显文; 关键词：禽呼肠孤病毒体外转录荧光定量RT-PCR; 文献传递

禽呼肠孤病毒δ3和δ2重组蛋白作为ELISA检测抗原的研究: 将纯化好的两个ARV结构蛋白δ和δ作为包被用抗原,分别进行间接ELISA,并确定它们的最佳抗原包被浓度分别为9.5μg/mL和12.0μg/mL;一抗血清的稀释度为1:200;HRP酶标羊抗鸡IgG稀释度为1:5000。...; 秦春香谢芝勋谢丽基刘加波庞耀珊邓显文谢志勤; 关键词：禽呼肠孤病毒结构蛋白间接ELISA; 文献传递

禽呼肠孤病毒σNS和σC基因shRNA载体构建及其干扰效果测定: 2012年; 禽呼肠孤病毒σC基因是病毒粘附蛋白,σNS基因具有结合单链RNA活性。根据siRNA靶序列设计原则,设计并合成siRNA模板并克隆到shRNA表达载体pSilencer-CMV 4.1 neo。分别构建了针对σC基因的shRNA载体C1、C2、C3和针对σNS基因的shRNA载体NS1、NS2、NS3。将构建的shRNA载体和阴性对照分别与表达σC和σNS基因的融合蛋白的真核表达载体pEGFP-σC及pEGFP-σNS共转染DF-1细胞。荧光显微镜观察结果表明,6个shRNA片段不同程度地抑制各自融合蛋白的表达。Real-time PCR检测结果表明,C3和NS1体外干扰病毒复制的效果最佳。; 熊文婕谢芝勋刘加波庞耀姗谢志勤邓显文谢丽基; 关键词：禽呼肠孤病毒 SHRNA

禽呼肠孤病毒分离株σ2蛋白基因克隆及序列分析被引量：1: 2010年; 为了解禽呼肠孤病毒(ARV)广西分离株与常用疫苗株在基因水平上的差异,将从广西某鸡场分离获得的2株ARV(R1、R2)分离株的σ2蛋白基因经RT-PCR扩增后,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经PCR、双酶切鉴定及序列分析。结果表明,2株ARV分离株的σ2蛋白基因已成功克隆到质粒载体上;经序列分析发现,2株ARV分离株与ARV标准株S1133的核苷酸同源性分别高达99.2%和99.3%,其推导的氨基酸同源性分别高达98.1%和98.4%;两分离株间的核苷酸同源性为99.7%,其推导的氨基酸同源性为98.5%,具有很高的同源性。; 谢志勤谢芝勋邓显文宋杨温娟刘加波庞耀珊谢丽基蓝如束张振荣黄海强; 关键词：禽呼肠孤病毒分离株

禽呼肠病毒3个编码蛋白的基因密码子偏爱性分析被引量：3: 2007年; 应用EMBOSS的CHIPS和CUSP程序对禽呼肠病毒(ARV)3个编码蛋白的基因密码子偏爱性进行分析,其结果与大肠埃希菌、酵母及人的密码子偏爱性进行比较。结果显示,ARVσC、ARVσB和ARVσNS的Nc(Effective number of condons)值为56.689、56.457和51.532。3种蛋白的部分编码密码子使用频率有较大的差异,其与大肠埃希菌、酵母及人的密码子偏爱性也有不同,表明ARVσC和ARVσNS的密码子与原核生物及人的相差较大,其表达系统选择在酵母较为合适,而ARVσB的密码子与原核生物较近,其表达系统选择在大肠埃希菌较为合适。; 谢丽基谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文; 关键词：禽呼肠病毒密码子

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