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蛋白质组学研究方法及应用的研究进展被引量：7: 2014年; 蛋白质是细胞生理功能的具体执行者,并常以蛋白复合体或与核酸相互作用的形式来发挥作用。蛋白质组代表在一定时间和特定条件下,1个细胞、组织或生物个体所表达的全部蛋白,因此蛋白质组会随着时间和空间的改变而发生动态变化。蛋白质组学从整体水平研究蛋白质组的结构、功能、表达模式及其相互作用的方式。根据研究内容的不同,蛋白质组学可分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学等。研究蛋白质组学有助于了解蛋白的结构、细胞的功能、生命的本质及活动规律,为疾病的诊断、治疗、疫苗及新药开发提供科学依据。研究蛋白质组学的常用手段主要有:双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱、酵母双杂交系统及蛋白芯片法等,文章将对蛋白质组学常用的技术方法及应用进行综述。; 谭伟黄莉谢芝勋; 关键词：蛋白质组学双向凝胶电泳质谱蛋白质分析

直接免疫荧光检测禽呼肠孤病毒方法的建立被引量：9: 2012年; 本研究利用经纯化的原核表达禽呼肠孤病毒(ARV)结构蛋白σ3作为免疫抗原,免疫兔子三次,血清效价达到27时采血分离血清。用硫酸铵沉淀法浓缩纯化血清中的IgG,纯化的IgG用荧光素FITC加以标记。利用制备的荧光标记特异性抗体和对反应条件进行优化,建立了表达σ3蛋白荧光抗体检测ARV的诊断方法。结果经纯化获得特异性抗ARV结构蛋白σ3的荧光标记IgG抗体。用标记的抗体检测ARV病毒感染的单层细胞,出现特异性的荧光。用建立的σ3-FA方法检测接种疑似ARV感染的病料的鸡胚原代成纤维细胞,检出的阳性样品与病毒分离结果一致。表明本研究建立的σ3-FA方法检测ARV病毒有较好的特异性,可用于ARV感染的临床样品检测。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基范晴; 关键词：禽呼肠孤病毒直接免疫荧光

禽呼肠孤病毒S1733株单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立被引量：7: 2013年; 将禽呼肠孤病毒(ARV)S1733株进行鸡胚增殖,增殖的病毒经浓缩、纯化后灭活,按每鼠100μg的病毒用量免疫BALB/c小鼠5次,每次间隔7 d,第五次免疫3 d后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合及筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,用克隆的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。抗体经Western blotting、Dot-ELISA、直接免疫荧光等方法进行检测验证。经验证的的单克隆抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA方法检测ARV。对建立的方法进行特异性和敏感性试验。结果:筛选成功获得1株能稳定分泌抗ARV的单克隆抗体杂交瘤细胞株SF6-3 K3;免疫荧光和Dot-ELISA方法证明该单克隆抗体能特异性地检测ARV;间接ELISA方法测定腹水单克隆抗体效价达105以上,经亚型测定为IgG1,并且具有良好的特异性;用单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA方法特异性强,与对照的毒株新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)无交叉反应,检测的敏感性为5×10-5μg/μL的病毒量。结果表明,本试验建立的夹心ELISA检测ARV方法具有较高的特异性和敏感性,可以用于ARV的检测。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基范晴; 关键词：单克隆抗体夹心ELISA

鸡白细胞介素1β、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α基因荧光定量PCR检测方法的建立被引量：6: 2013年; 本研究根据GenBank上公布的鸡白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列,在保守区域各设计合成1对特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组阳性质粒。采用梯度稀释重组标准品质粒DNA,构建SYBR GreenⅠ染料法荧光定量PCR标准曲线。结果显示,各基因的熔解曲线均呈单一熔解峰,IL-1β、IL-18、TNF-α和GAPDH的扩增效率分别是101.2%、95.6%、100.1%和98.2%,相关系数分别为0.9996、0.9998、0.9957和0.9989。敏感性试验结果表明,该检测方法在35个Ct值内可检测到100个模板拷贝数;重复性试验结果表明,组内变异系数均小于1.4%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法可用于鸡IL-1β、IL-18和TNF-αmRNA的检测,为导致免疫抑制性疾病病毒感染宿主细胞后细胞因子表达的定量分析奠定基础。; 张昆丽谢芝勋滕丽琼刘加波谢丽基庞耀珊范晴邓显文罗思思谢志勤; 关键词：白细胞介素1Β 白细胞介素18 肿瘤坏死因子Α

禽呼肠病毒基因组及其编码蛋白研究进展被引量：1: 2018年; 呼肠病毒能感染鸡、火鸡和番鸭等禽类,主要引起雏鸡病毒性关节炎和腱鞘炎、矮小综合征和吸收障碍综合征及免疫抑制,以及雏番鸭肝坏死等。与哺乳动物呼肠病毒相比,禽呼肠病毒分子生物学方面的研究起步相对较晚。论文阐述了禽呼肠病毒的基因组结构及其所编码蛋白的结构与功能,为该病毒的研究提供参考。; 谭伟谢丽基谢芝勋; 关键词：禽呼肠病毒病毒基因组

鸡细小病毒与禽呼肠病毒二重PCR检测方法的建立被引量：10: 2016年; 建立可同时检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)与禽呼肠病毒(Avian reovirus,ARV)的二重PCR方法,为防控ChPV与ARV提供技术支撑。根据鸡细小病毒NS1基因和禽呼肠病毒σC基因的保守序列,设计合成两对引物用于检测ChPV和ARV,通过优化二重PCR的反应体系,特异性、敏感性试验评价建立的ChPV与ARV二重PCR。优化后的二重PCR反应体系为:2×PCR Mix 12.5μL,其中ChPV与ARV的上、下游引物各1.0μL,混合模板2.0μL,ddH2O补足25μL;最佳的反应程序为:95℃5min;95℃1min,56.1℃1min,72℃1min,35个循环;最后72℃延伸10min。结果显示,建立的二重PCR能够同时扩增出204bp ChPV和405bp ARV片段;该方法对ChPV与ARV的检测敏感性分别达到58fg和53fg,但对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒等病原体均无特异性扩增,对ChPV与ARV混合感染的临床阳性病料的检测结果与各病毒单项PCR检测结果符合率为94%以上。建立的二重PCR可用于ChPV与ARV感染的快速鉴别诊断。; 奉彬谢芝勋邓显文张艳芳黄娇玲王盛范晴谢志勤黄莉谢丽基曾婷婷罗思思刘加波; 关键词：禽呼肠病毒二重PCR 特异性敏感性

Construction of Short Hairpin RNA Vector with σNS & σC Genes of Avian Reovirus and Determination of Interference Effect: 2012年; [Objective] The aim was to explore novel method for treatment of Avian Reovirus. [Method] According to the design principle of siRNA target sequences, siRNA templates were designed and synthesized and then cloned into the shRNA expression vector, namely, pSilencer-CMV 4.1 neo. Short hairpin RNA vector C1, C2, C3, which contain σC gene, and shRNA vector NS1, NS2, NS3, which contain σNS gene, were constructed separately. The constructed shRNA vectors and negative control were co-transfected into DF-1 cells with the eukaryotic expression vector pEGFP-σC and pEGFP-σNS, respectively. [Result] Observation through fluorescence microscope indicated that the constructed 6 shRNA could inhibit the expression of fusion protein to different degrees. In addition, results of Real-time PCR suggested that C3 and NS1 have the best interference effect to the viral duplication in vitro. [Conclusion] Construction and selection of specific shRNA expression vectors inhibiting Avian Reovirus are significant for researching effects of σC and σNS proteins in infection and duplication of ARV, providing new idea for ARV antiviral therapy.; XIONG Wen-jieXIE Zhi-xunLIU Jia-boPANG Yao-shanXIE Zhi-qinDENG Xian-wenXIE Li-ji; 关键词：真核表达载体短发夹状RNA NS2 SHRNA 禽呼肠孤病毒逆转录病毒

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：9: 2015年; 【目的】建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考。【方法】采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法。【结果】构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=-0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高。在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0。【结论】建立的转基因烟草中外源基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析。; 王盛谢芝勋谢丽基谢志勤黄莉罗思思邓显文黄娇玲刘加波; 关键词：转基因烟草外源基因拷贝数 SYBR

禽呼肠孤病毒σ3蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定被引量：3: 2013年; 用体外表达的蛋白作为免疫原来制备特异的单克隆抗体,并对制备的抗体进行鉴定。将ARVσ3蛋白基因在体外扩增,扩增产物与载体PGEX-4T-1连接并在基因工程菌中表达,体外表达的蛋白经纯化后作为免疫原来制备特异的单克隆抗体和ELISA检测包被抗原,测定纯化后蛋白的浓度,按每鼠100μg的蛋白用量免疫BALB/c小鼠,免疫4次后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1进行融合。对融合后的杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,通过间接E-LISA方法测定其抗体效价,并通过Western Blot、Dot-ELISA、直接免疫荧光、病毒中和等方法对获得的单抗特性进行检测。结果通过纯化的病毒含量为41.5 mg/mL,应用纯化的病毒免疫BALB/c小鼠后与骨髓瘤细胞融合,通过克隆筛选成功获得1株能稳定传代并分泌抗禽呼肠孤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株σ3 B6-3 K3,用其制备的腹水经间接E-LISA测定效价达105以上,并且与其他参试病毒株没有交叉反应,具有良好的特异性;病毒中和试验证明其中和能力低。应用ARVσ3蛋白制备并获得的杂交瘤细胞株σ3 B6-3 K3具有很好的特异性,不具有中和ARV的关键表位,可以用于ARV的特异性检测。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基范晴; 关键词：禽呼肠孤病毒单克隆抗体

基于纳米材料电化学免疫传感器检测禽呼肠孤病毒研究被引量：3: 2014年; 【目的】构建一种用于检测禽呼肠孤病毒(ARV)的新型电化学免疫传感器。【方法】将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,加入HAuCl4溶液于80℃还原成金纳米粒子(AuNPs),得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子(G-Chi-AuNPs)纳米复合物。将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,先加入AgNO3溶液于80℃还原成银纳米粒子(AgNPs),再加入禽呼肠孤病毒单克隆抗体(ARV-MAb),得到石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子-禽呼肠孤病毒单克隆抗体(G-Chi-AgNPs-ARV-MAb)纳米复合物。将G-Chi-AuNPs纳米复合物修饰金电极作为传感器平台,固定待检测样品,然后加入G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物,并对G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的孵育时间进行优化,构建了ARV电化学免疫传感器。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对禽流感(H5N1、H3N6和H9N2亚型)、新城疫病毒(NDV)、喉气管炎病毒(LTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的特异性。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对106.5—100.5 TCID50/mL的病毒进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的敏感性试验。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对临床样品进行检测,其确定ARV电化学免疫传感器的实用性。【结果】所建立的ARV电化学免疫传感器,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的最佳孵育时间为40 min。当检测的样品为阳性时,ARV与ARV-MAb特异结合,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物被固定到电极的表面使其线性伏安曲线出现AgNPs的氧化峰;当检测样品为阴性时,其线性伏安曲线不出现AgNPs的氧化峰。特异性结果表明,所建立的方法仅对ARV的检测为阳性(出现AgNPs的氧化峰),而对非目标禽流感(H5N1、H3N6和H9N2亚型)、NDV、LTV、IBV和IBDV的检测为阴性(不出现AgNPs的氧化峰)。敏感性结果表明,所构建的ARV电化学免疫传感器,�; 黄娇玲谢芝勋谢丽基滕丽琼黄莉刘加波庞耀珊邓显文谢志勤范晴罗思思; 关键词：石墨烯电化学免疫传感器金纳米粒子银纳米粒子禽呼肠孤病毒

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