葛猛
- 作品数：61 被引量：107H指数：6
- 供职机构：湖南农业大学动物医学院更多>>
- 发文基金：湖南省科技重大专项国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程医药卫生更多>>
- 猪瘟E^rns蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其抗体间接ELISA方法的建立
- 2020年
- 将人工合成的CSFV E^rns基因插入到pFastBac1获得重组转移载体pFastBac1-E^rns,在DH10Bac大肠杆菌中转座后提取杆粒并转染Sf9细胞,用获得的重组杆状病毒感染High Five细胞表达E^rns蛋白并通过亲和层析进行纯化。以纯化后E^rns蛋白作为诊断抗原,通过摸索抗原包被量和抗体血清稀释倍数等条件,建立检测CSFV E^rns抗体的间接ELISA方法(E^rns-iELISA)。结果显示,E^rns蛋白得到有效表达,相对分子质量约为35000;确定的ELISA抗原包被量为120ng/孔、血清稀释100倍,酶标二抗稀释6000倍,封闭条件为37℃30min,TMB底物作用15min,临界值为0.329。用E^rns-iELISA方法检测92份阴性血清,其特异性为88.04%,与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应;对171份阳性血清的敏感性为92.98%;批内和批间重复的平均变异系数为7.4%和10.74%。结果表明,本试验所建立的E^rns-iELISA方法重复性好,具有较高的检测特异性,且对CSFV疫苗毒和国内流行毒株都具有较高的检测敏感性,具有潜在的开发和应用价值。
- 任杰葛猛李润成郑金凌同黎满香李岱霞张磊余兴龙
- 关键词：猪瘟病毒杆状病毒表达系统抗体间接ELISA
- 用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆B细胞的ELISpot试剂盒及其应用
- 本发明提供了蛋白组合和用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆B细胞的ELISpot试剂盒及其应用，属于兽医生物技术领域；所述蛋白组合包括Cap‑2b和Cap‑2d。Cap‑2b和Cap‑2d分别为PCV2b和PCV2d的Cap...
- 葛猛范方程李润成胡泽奇
- 副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的原核表达及其表达产物的免疫原性被引量：7
- 2010年
- 根据GenBank中登录的副猪嗜血杆菌(HPS)D15基因鸟枪序列(登录号:NZ_ABKM01000005)设计1对特异性引物,以HPS5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增了D15基因。将其进行T-A克隆,构建pMD18D15质粒并进行序列测定和分析。结果表明,D15基因含有一个2418bp的开放阅读框,编码805个氨基酸,与D15基因参考序列的同源性为99.9%。该HPSD15基因的推导氨基酸序列具有典型Omp85蛋白家族的拓扑结构特征。以pMD18D15质粒为模板,用PCR方法扩增HPSD15基因,并将其克隆到pET-28a(+)中,构建pETD15原核表达质粒,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导重组菌,并用SDS-PAGE和Western-blot检测诱导物。结果表明,pETD15重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白的分子质量约为94ku,融合蛋白能被HPS阳性血清识别,提示该融合蛋白具有反应原性。昆明小鼠和豚鼠免疫试验结果表明,D15重组蛋白具有一定的诱导免疫保护反应的能力。
- 朱小宁余兴龙盛益颖李润成罗维葛猛刘俊奇刘春红肖利军将大良
- 关键词：副猪嗜血杆菌外膜蛋白原核表达免疫原性
- O型口蹄疫病毒VP1基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析被引量：1
- 2009年
- 以质粒pMDTLT为模板、用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1。转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性。小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组。
- 李润成余兴龙白霞向卫军葛猛黎满香
- 关键词：口蹄疫病毒VP1基因LTB基因抗体效价
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒08HuN株基因组序列测定与分析
- 通过分段设计引物，应用RT-PCR方法分6段扩增出非高致病PRRSV08HuN变异株的全基因组，扩增后的产物分别克隆于pMD19-T Simple载体鉴定后测序，应用DNAStar软件按顺序将测序结果拼接得到该毒株全基因...
- 肖利军余兴龙肖博仁李润成杨兴东葛猛李杰
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RT-PCR法
- 文献传递
- 对兽医传染病诊断教学实习课程改革的探讨
- 2019年
- 兽医传染病诊断实践是一门实践性很强的动物医学类专业实习课程,教学方法对实习效果有较大影响。针对目前教学实习过程中存在教学实习体系不健全,实验室诊断与临床诊断脱节,甚至没有临床诊断的问题,笔者提出了与养殖企业合作建立远程辅助教学实习平台,与兽医第三方检测机构合作开发新的实习基地,以及人为"造病",模拟真实的发病状态的三点解决方案。新的教学实习办法将更加适合现在的养殖新模式和教学新形式,从而使学生能够更加全面地学习和掌握兽医传染病诊断方法。
- 葛猛李润成
- 关键词：教学方法教学改革
- 湖南省健康猪群中不同基因型猪博卡病毒流行性及进化分析被引量：3
- 2017年
- 为了解猪博卡病毒在不同年龄健康猪群中的感染情况,通过对GenBank登录的猪博卡病毒基因序列分析设计2对引物可分别扩增PBoV1/2的部分NS1基因和PBoV3/4/5的部分VP1基因。提取2016年8-12月收集自湖南5个集约化猪场2~20周龄猪共430份肛门拭子样品的DNA并进行PCR检测。PBoV阳性率为64.6%(278/430),PBoV1/2阳性率为27.2%(117/430),PBoV3/4/5阳性率为45.1%(194/430),混合感染率为7.7%(33/430),PBoV3/4/5阳性率显著高于PBoV1/2阳性率(P=0.034)。PBoV1/2在2~10周检出率高于其他周龄,但是与其他周龄猪体内检出率统计分析无显著性差异,PBoV3/4/5主要感染8~16周猪,与4周以内猪差异显著,与其他猪群差异不显著。对各型的核苷酸与参考序列核苷酸相似性分析显示PBoV1/2之间的平均相似度为85.4%,PBoV3/4/5之间的平均相似度为67.2%。PBoV在健康猪群中流行广泛且存在共同感染现象,对猪的健康尤其是肠道微生物平衡可能存在潜在影响。
- 屈泰龙李润成罗斌宇葛猛严美君胡辉灿余兴龙
- 关键词：流行性进化分析
- 基于胞内劳森菌重组flgE蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用被引量：2
- 2021年
- 为建立以胞内劳森菌(LI)重组鞭毛钩基体复合蛋白flgE为包被抗原的间接ELISA检测方法,本研究将flgE基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-flgE,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的flgE重组蛋白。以纯化的重组flgE蛋白为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测LI抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的ELISA方法与CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV、Mhp和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法能检测到1600倍稀释的LI阳性血清,批内和批间变异系数均小于10%。利用该方法检测多个不同类型猪场的猪血清(血清来源:2个种猪场1~5胎次的母猪;3个商品猪场30日龄~140日龄的猪;仔猪30头,从30日龄跟踪至80日龄,共采集4次血清),结果显示,母猪和育肥猪的感染率较高可达100%;母源抗体下降后,自50日龄~70日龄起到育肥猪阶段,LI阳性率和抗体水平随着日龄的增长而不断上升;30头跟踪仔猪在单独密闭的饲养条件下,从开始到全群感染LI所需的时间较短(35 d左右)。这些结果与目前已报道的LI血清流行病学调查研究一致,表明该方法能较准确反映LI感染猪的抗体水平。上述结果表明本研究建立的间接ELISA抗体检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性,可初步用于临床LI血清流行病学的调查。
- 廖荣莉郑金熊梦霞罗灵芝赵墩周阳唐红剑葛猛葛猛
- 关键词：间接ELISA
- 副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的克隆与表达及表达产物的免疫原性分析
- 根据已发表的副猪嗜血杆菌D15基因鸟枪序列NZBKM01000005,设计一对特异性引物,以副猪嗜血杆菌5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增出长约2400多bp的片段.将其进行T-A克隆,构建pETD15质粒并进...
- 朱小宁余兴龙盛益颖李润成罗维葛猛刘俊奇刘春红肖利军将大良
- 关键词：副猪嗜血杆菌外膜蛋白原核表达免疫原性
- 文献传递
- 猪圆环病毒3型抗体ELISA检测方法建立及其应用
- 2021年
- 本研究将猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白截去核定位序列(NLS)后对应的dCap基因克隆至pET28a(+)并转入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌后进行蛋白表达。采用镍离子亲和层析纯化dCap蛋白。将纯化的dCap蛋白作为抗原进行包被,建立检测PCV3抗体的间接ELISA方法,并对湖南省1175份临床血清进行检测。结果显示:dCap蛋白主要以包涵体形式表达,当以pH为10.83的碳酸盐缓冲液将纯化的dCap蛋白稀释到0.2μg/mL并进行包被,且血清50倍稀释,酶标二抗1∶8000稀释时,ELISA的反应条件最佳,确定S/P临界值为0.270,批内及批间差异均小于10%,本方法与PCV2、CSFV、PRV和PRRSV阳性血清无交叉反应。对湖南省11个地级市的29个猪场的血清流行病学调查结果表明:PCV3抗体猪场阳性率为100%(29/29),样品总阳性率为58.64%(689/1175),但阳性样品主要集中在肥猪和母猪,且阳性率在肥猪阶段明显上升,说明猪群感染PCV3主要是在育肥阶段。
- 谢怡灵李润成赵墩杜丽飞熊梦霞宁柯铭李双寅黎满香黎满香
- 关键词：CAP蛋白间接ELISA
