目的:构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)的开放读码框2(ORF2)基因的真核表达载体pEGFP-ORF2,并检测其在SH-SY5Y细胞中的表达。方法:采用亚克隆技术构建HSV-2 LAT ORF2与EGFP基因融合的真核细胞表达载体pEGFP-ORF2,双酶切及测序鉴定;脂质体法转染试剂将重组载体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选20天挑取表达pEGFP-ORF2的抗性克隆扩大培养,传代。荧光显微镜直接观察重组体在细胞中的表达。结果:重组质粒pEGFP-ORF2序列和方向正确;EGFP-ORF2融合基因在SH-SY5Y细胞中获得表达。结论:成功建立稳定表达pEGFP-ORF2的SH-SY5Y细胞株,为进一步研究HSV-2 LAT ORF2基因的功能奠定了实验基础。
目的:研究单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体(LAT)开放读码框(ORF)对凋亡诱导剂诱导Vero细胞凋亡的影响。方法:PCR扩增LAT ORF1、ORF2、ORF3片段,构建重组质粒pEGFPORF1、pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3,重组质粒pEGFP-ORF1、pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3转染Vero细胞;RT-PCR鉴定ORF1、ORF2、ORF3的表达。用凋亡诱导剂放线菌素D、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导Vero细胞凋亡,通过荧光显微镜观察细胞形态学的改变,MTT检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:双酶切和测序确认pEGFP-ORF1、pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3构建成功,RT-PCR表明这3个真核表达载体能在Vero细胞中高效表达。转染各种pEGFP-ORF的Vero细胞经凋亡诱导剂诱导后,细胞形态正常。MTT结果表明转染了各种重组质粒pEGFP-ORF的Vero细胞经凋亡诱导剂诱导后Vero细胞活性与未经任何处理的正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),但高于凋亡诱导剂诱导凋亡的Vero细胞组及与转染空质粒pEGFP-C2,且经凋亡诱导剂诱导的Vero细胞组,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术结果表明,转染各种重组质粒pEGFP-ORF且经凋亡诱导剂诱导凋亡组与正常对照组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),而显著低于转染空质粒pEGFP-C2且经凋亡诱导剂诱导凋亡组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HSV-2 LAT ORF对凋亡诱导剂诱导的Vero细胞的凋亡具有抵抗作用。
