来大志
- 作品数：19 被引量：89H指数：6
- 供职机构：军事医学科学院微生物流行病研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 对外源基因进行正确分泌表达的多拷贝酵母表达载体
- 本发明涉及一种酵母表达载体及其构建引物。本发明的目的是提供一种能够使外源基因在酵母中正确分泌表达的多拷贝酵母表达载体，它的DNA序列为序列表中序列1的核苷酸序列。本发明的第二个目的是提供二对构建上述表达载体的专用引物，其...
- 陈薇齐连权于长明付玲来大志
- 文献传递
- 通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培养被引量：5
- 2004年
- 哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中 ,哺乳动物细胞生长活力差 ,且容易发生细胞凋亡 ,因而难以大规模培养。为解决此问题 ,应用双顺反子表达载体在CHO dhfr- 细胞中同时表达Igf 1 Bcl 2或Bcl 2 CyclinE基因组合 ,通过Bcl 2使细胞获得抗凋亡能力 ;通过Igf 1或CyclinE促进细胞生长分裂 ,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO dhfr- 细胞 ,应用Westernblot从G4 18抗性克隆中分别筛选到Bcl 2高表达克隆若干个 ,对其中表达Bcl 2最高的CHO IB3和CHO BC1做进一步Westernblot和流式细胞分析 ,确认此两个细胞株分别高表达Igf 1 Bcl 2和Bcl 2 CyclinE基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡 ,并以流式细胞术和DNALadder法检测细胞凋亡 ,证明CHO IB3和CHO BC1均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO dhfr- 对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明 ,CHO IB3和CHO BC1在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHO dhfr- 对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长 ,适于作为生物工程宿主细胞。
- 来大志翁少洁齐连权于长明付玲于婷陈薇
- 复合干扰素突变体在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析被引量：4
- 2003年
- 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素突变体基因 ,克隆至分泌型酵母表达载体pMEX9K ,将重组载体pMEX CIFNm用SacⅠ线性化后 ,转化毕赤酵母GS115 .转化子经诱导后 ,培养上清有抗病毒活性的蛋白产生 .经过离子交换 ,疏水层析 ,凝胶过滤三步层析纯化 ,得到了纯度大于95 %的重组复合干扰素突变体 ,经N端氨基酸序列分析表明 ,该蛋白N端序列与理论值一致 ,质谱测定分子量为 19 3kD ,与理论值一致 .用细胞病变抑制法测定其活性 ,并结合Lowry法蛋白定量计算其比活性为 6× 10 8IU mg ,与复合干扰素的比活相当 .
- 于长明付玲齐连权张晓鹏于婷来大志王海涛陈薇
- 关键词：毕赤酵母纯化活性
- 毕赤酵母表达系统研究进展被引量：33
- 2002年
- 毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题 ,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题 ;并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。至今已有多种外源蛋白在该表达系统中成功表达。下面对毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作一简要综述。
- 齐连权陈薇来大志于长明王海涛
- 关键词：毕赤酵母
- 表位水平研究病毒流行病学的方法探讨被引量：2
- 2002年
- 应用噬菌体随机展示肽库和硫氧还蛋白表面展示技术 ,建立了在表位水平研究病毒流行病学的方法 ,并以丙型肝炎病毒核心区蛋白做了初步验证 。
- 来大志杜勇杜桂鑫陈薇王海涛
- 关键词：表位流行病学肽库噬菌体硫氧还蛋白HCV
- 重组人干扰素ω在制备非典型肺炎防治药物中的应用
- 本发明公开了重组人干扰素ω在制备防治非典型肺炎药物中的用途。人干扰素ω具有较强的抗病毒能力，对SARS病毒感染细胞具有明显保护作用。用人干扰素制备ω的药物具有广阔的市场前景和良好的社会效益。
- 陈薇齐连权于长明付玲来大志
- 文献传递
- 人IFN-β启动子基因报告质粒的构建及SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生作用的初步研究被引量：2
- 2006年
- 3a蛋白和7a蛋白是SARS-CoV的非结构蛋白,分别主要由SARS基因组中ORF3a和ORF7a所编码。在体内和体外感染病毒的细胞中均发现了有3a蛋白的表达。首先将pGL3-Control载体进行了改构,除去了SV40启动子基因,获得了pGL3-Enhancer载体,将获得的IFN-β启动子基因连入载体中,构建了带有人IFN-β启动子基因的荧光素酶报告质粒IP-21,并且通过实验证明所构建的质粒在干扰素的诱导剂NDV的作用下能够表达荧光素酶活性,照度计检测荧光素酶活性增强,从而验证了所构建的重组质粒的有效性。为了观察SARS-CoV非结构蛋白3a和7a对干扰素诱生途径的影响,将IP-21瞬转入稳定表达有3a和7a蛋白的CHO细胞,通过荧光素酶的信号强弱对3a和7a的作用进行分析,结果表明SARS-CoV的3a和7a蛋白能够刺激荧光素酶的表达,即在体外的细胞实验中,3a和7a能有效地激活IFN-β的启动子部分。此结果对进一步研究3a和7a的功能以及对SARS-CoV的致病机制的进一步研究有一定意义。
- 徐春娥付玲侯丽华翁少洁来大志李健民于婷于长明陈薇
- 关键词：SARS-COV
- 改造中国仓鼠卵巢细胞被引量：13
- 2002年
- 与原核细胞、酵母细胞以及昆虫细胞相比 ,中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)作为宿主细胞表达的外源蛋白最接近其天然构象 ,因而CHO细胞表达系统是生物工程制药最为理想的表达系统。但这种系统也存在诸多缺点。如在大规模培养中CHO细胞会面临着对无血清培养基的适应性差、细胞无限度增殖以及细胞凋亡等很多难题。所以除了在培养基、培养条件和表达载体方面下功夫优化该系统外 ,对CHO细胞本身进行改造已成为优化CHO表达系统的另一热点。
- 来大志齐连权于长明王海涛陈薇
- 关键词：中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞细胞凋亡细胞黏附细胞周期
- 两个新型多拷贝毕赤酵母表达载体的构建被引量：7
- 2002年
- 目的 :构建合适的载体用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法 :利用PCR技术 ,对已有载体pPIC9K进行改造 :在多克隆位点处增加一个NaeⅠ酶切位点 ;去除卡那霉素抗性基因中的一个XhoⅠ酶切位点。结果和结论 :成功地构建了pMEN9K ,pMEX9K两个载体 。
- 齐连权陈薇于长明来大志翁少洁王海涛
- 关键词：巴斯德毕赤酵母基因表达PCR
- 人β干扰素基因的改构及其融合表达和纯化被引量：7
- 2002年
- 目的 :通过基因改构来提高人 β干扰素基因原核表达产物的稳定性和比活性。 方法 :用RT_PCR法从人外周血淋巴细胞中获得人 β干扰素基因。定点突变后 ,克隆至表达载体pGEX_2T。IPTG诱导该基因的表达 ,亲和层析和原位裂解法纯化表达产物。结果 :获得大量纯化产物 ,且稳定性和活性获得极大提高。结论 :基因改构可以提高人
- 来大志陈薇付玲齐连权于长明翁少洁王海涛
- 关键词：Β干扰素稳定性RT-PCRΒ干扰素纯化
