- 1.丙型肝炎病毒核心蛋白通过自诱导方式可溶性表达及其生物学功能鉴定;2.深度测序分析HBV感染中多基因型混合感染
- 本论文分成两部分，均是方法学研究。第一部分研究了一个新的用于蛋白表达的方法学，使以往无法表达的HCV完整核心蛋白成功地被可溶性表达，并对该蛋白进行了生物学鉴定;第二部分研究了高通量测序在临床基因分型中的应用，并以此方法分...
- 龚旭阳
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性表达
- HBV DNA环化结构在体外的复制表达水平优于HBV线性结构的表达质粒
- 2013年
- 为了研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA环化结构与HBV线性结构的表达质粒在体外复制表达水平的差异,采用3种含有HBV全长DNA的表达质粒与自连环化的HBV DNA分别转染Huh7细胞.5 d后收集转染处理过的Huh7细胞和细胞上清,从感染细胞中抽提纯化HBV复制中间体进行Southern印迹分析,并将细胞培养上清进行ELISA分析.结果显示,HBV DNA通过环化后转染Huh7细胞,可高效地进行转录和复制表达,且优于质粒转染的效果.证明在细胞中,HBV DNA环状结构的复制表达能力优于HBV线性结构的表达质粒.
- 马其欢杜茜龚旭阳胡接力黄爱龙蔡雪飞
- 关键词：乙型肝炎病毒
- HBV患者不同临床状态下准种特征和密码子使用偏好分析
- 乙型肝炎病毒是全球公共卫生的一个重大威胁。全世界范围内目前有三亿多携带者。中国是乙型肝炎病毒感染的重灾区。在我国大部分的肝癌与病毒性肝炎有关。乙肝疫苗很大程度乙肝病毒的感染率,但存在接种失败和免疫逃逸现象。核酸类似物是治...
- 龚旭阳
- 关键词：病毒准种密码子
- 文献传递
- 丙型肝炎病毒核心蛋白通过自诱导方式可溶性表达及其生物学功能鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的构建包含HCV核心蛋白全长基因的重组原核表达质粒，经转化表达型大肠杆菌后自诱导培养以获取可溶性重组核心蛋白，并检测其生物学功能。方法以H／FL质粒为模板，通过PCR扩增全长HCV核心蛋白DNA。PCR产物经双酶切后定向克隆到pET28a原核表达载体中。将重组的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，并通过自诱导培养的方式使其在高浓度状态下表达重组核心蛋白。重组核心蛋白经Westernblot检测鉴定生物学功能，并与HCVNS3蛋白进行相互结合后共同纯化实验。结果重组核心蛋白大量存在于表达菌破菌上清液中。Westernblot检测结果显示其具有核心蛋白抗原性。重组核心蛋白不能单独通过Ni-NTA亲和层析柱纯化，但可以与HCVNS3蛋白结合后共同纯化。结论成功表达可溶性的重组核心蛋白，证明了其生物学活性。重组核心蛋白与HCVNS3蛋白存在相互作用。
- 龚旭阳马其欢杜茜胡接力蔡雪飞黄爱龙
- 关键词：肝炎病毒丙型蛋白质类质粒
- 低拷贝HBV病毒全长DNA的制备和体外复制水平的鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的:从乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)低拷贝的血清样本中提取病毒DNA并通过PCR扩增得到全长DNA片段。将全长片段经过环化处理后转染HuH7细胞,体外评价病毒的复制水平。方法:设计含有BspQⅠ酶切位点的HBV全长扩增引物和分段扩增引物,选择HBV低拷贝的临床病人血清样本,经抽提纯化后的病毒DNA作为模板,用巢式PCR结合分段扩增的方法扩增得到HBV全长DNA,PCR产物经BspQⅠ酶切后自连环化,将环化的HBV DNA转染HuH 7细胞,经5 d细胞培养,提取细胞中的病毒复制中间体,通过Southern blot分析病毒复制水平。结果:通过PCR扩增得到5个HBV全长DNA,经过酶切连接全长基因后转染HuH7细胞,Southern blot检测均有复制表达。结论:本实验成功构建能够有复制表达的HBV环化全长,为研究血清中低拷贝HBV病毒的不同病人复制水平与DNA序列关系打下基础。
- 杜茜马其欢龚旭阳蔡雪飞
- 关键词：乙肝病毒
- 重组GST-HBx蛋白在表达过程中断裂状况的研究
- 2011年
- 目的 在对乙型肝炎病毒非结构蛋白HBx研究的过程中,发现体外表达HBx蛋白产物的稳定性存在差异.为了了解其中的原因,拟通过原核表达方式进行分析.方法 以包含全长HBV DNA的质粒pEco63为模板,通过PCR反应,扩增HBV X基因全长序列（1～154氨基酸）和截短序列（48～104氨基酸,48～146氨基酸,98～146氨基酸）,将这几种不同长度和位置的HBX DNA序列克隆到pGEX4T-2原核表达载体中,并通过下游引物设计中引入6×组氨酸标签序列.结果 最终成功构建N端融合GST蛋白标签序列和C端融合6×组氨酸标签序列的4种HBx重组表达载体.将4种包含不同长度HBx的重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta,培养至菌液浓度A值大约0.6左右,加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.提取全菌蛋白通过Western印迹对HBx各重组蛋白产物的N端和C端进行检测.结论 在分段表达的HBx重组蛋白中发生了多处局部的断裂,而断裂部位主要集中于GST蛋白上.而造成这一结果的原因可能与HBx蛋白功能区域暴露后与GST相互作用有关.
- 蔡雪飞龚旭阳杜茜胡接力张文露胡源黄爱龙汤华
- 关键词：HBX蛋白原核表达
