王丁丁
- 作品数：32 被引量：55H指数：5
- 供职机构：广东药学院生命科学与生物制药学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省教育厅高水平科研项目广东省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- 一种融合抗体ScFv-Fc通用表达载体的构建被引量：2
- 2011年
- 为了构建一个可供自由替换的ScFv区,表达人小分子融合抗体ScFv-Fc的通用载体,利用RT-PCR技术扩增人抗体IgG1的Fc片段克隆至毕赤酵母表达载体pPICZα,将一段人工合成的互补寡核苷酸链插入重组载体pPICZα/Fc中Fc区的上游,引入2个可供小分子抗体ScFv-Fc的ScFv区自由替换的限制性酶切位点。分别扩增人抗狂犬病毒以及抗乙型肝炎表面抗原的ScFv片段,克隆至已构建的通用载体pPICZα/Fc,在毕赤酵母中诱导表达。进一步在1L条件下对活性抗体进行发酵,并利用proteinA亲和层析柱进行纯化。应用酵母基因组PCR、ELISA、Western blotting、活性检测等试验对此小分子抗体的表达进行生物学及免疫学分析。结果表明具有狂犬病毒抗原结合活性以及乙肝表面抗原结合活性的人源抗体分子均获得成功表达,1L发酵条件下表达量达到20～30mg/L,protein A亲和层析纯化后纯度>95%。研究构建了可用于功能性抗体分子ScFv-Fc筛选和表达的通用载体并对其发酵、纯化条件进行了摸索,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。
- 王丁丁苏曼曼胡丽莉袁丽颖孙艳汪炬颜炜群
- 关键词：毕赤酵母
- HepG2细胞诱导下TCR Vα基因的选择性表达研究
- 2012年
- 目的研究HepG2细胞诱导下T细胞受体(TCR)Vα亚家族基因的选择性表达情况。方法将HepG2细胞与健康人外周血单个核细胞(PBMC)混合培养,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等检测混合培养前后TCR Vα各亚家族基因表达变化。结果混合培养不同时间TCR Vα各亚家族基因表达有一定的变化但并未筛选出针对HepG2细胞特异性表达的TCR Vα亚家族,HepG2和PBMC可能在混合培养96h时相互作用最大。结论在HepG2细胞诱导下,TCR Vα各亚家族基因有一定的选择性但没有明显的特异性表达。
- 胡丽莉余雪松王丁丁崔泽凯曾婉慧
- 关键词：HEPG2细胞TCR
- 集体教研活动的改革与探索
- 2013年
- 集体教研对于发挥教师团队合作精神,取长补短,集思广益,具有不可或缺的作用。我们在前期工作的基础上改变传统的集体教研活动的模式,让学生参与集体教研活动,凸显学生的主体地位,并在集体教研活动的制度化与规范化方面做了有益的尝试。
- 余雪松贾伟章胡海梅王丁丁胡丽莉黄树林
- Mdfic与Rhox5蛋白相互作用的关键结构域鉴定
- 2012年
- Mdfic(MyoD family inhibitor domain containing)是一个新发现的含有MyoD抑制素结构域(I-mfa domain)的转录调控因子,可能在肌细胞的分化过程中发挥重要作用.小鼠Rhox5为同源异型框基因,隶属于Rhox基因簇(reproductive homeobox on the X chromosome genes cluster)β亚簇.在前期证实Mdifc能结合Rhox5蛋白的基础上,进一步鉴定两者相互作用的关键结构域.生物信息学分析Mdfic的氨基酸序列,PCR方法扩增Mdfic A截短型片段(第72～247位氨基酸残基),含保守的I-mfa结构域;双向酵母双杂交和体外GST-Pull down结果表明,该截短型片段可以与Rhox5蛋白结合,且结合力度较完整的Mdfic蛋白强;将Mdfic A片段划分为两段:Mdfic B(72～191 aa,不含I-mfa结构域)和Mdfic C(191～247 aa,含I-mfa结构域).结果表明,含保守I-mfa结构域的Mdfic C截短型片段丧失了与Rhox5蛋白结合的能力,而不含I-mfa结构域的Mdfic B截短型片段可以结合Rhox5蛋白.鉴于Mdfic蛋白的非I-mfa结构域在Rhox5/Mdfic结合中发挥关键作用,Rhox5与Mdfic的结合可能进一步调控由Mdfic的I-mfa结构域参与的其他转录因子(如MyoD)的调控,三者形成一个复杂的调控网络,共同参与肌细胞发生及分化的调控.
- 郭芬欧淑芳初彦辉李月琴王丁丁周天鸿
- 关键词：转录因子
- 华南地区汉族人群BCRP基因G34A和C421A多态性
- 2013年
- 目的研究乳腺癌耐药蛋白(BCRP)单核苷酸多态(SNP)G34A和C421A在华南地区汉族人群中的分布,同时比较不同地区人群间BCRP基因型及等位基因频率分布的差异。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法,检测华南地区无亲缘关系的汉族人群BCRP基因G34A和C421A多态性,结合文献比较不同人群间等位基因频率的差异。结果华南地区人群BCRP基因G34A基因型分布频率为:GG基因型267例(39.03%)、GA基因型328例(47.95%)、AA基因型89例(13.02%)。C421A基因型分布频率为:CC基因型288例(45.79%),CA基因型277例(44.04%),AA基因型64例(10.17%)。其基因型频率在东亚、高加索以及非洲人群中的分布存在显著差异(P<0.05)。结论 BCRP基因在华南汉族人群中存在G34A和C421A多态性,其在不同人群中的分布频率存在显著差异。
- 胡丽莉王丁丁苏升志林尉璇张建权
- 关键词：汉族
- 人源化卵巢癌单链抗体基因的构建与表达被引量：1
- 2008年
- 目的:通过基因工程技术获得完全人源化的卵巢癌患者自身的单链抗体并在毕氏酵母中获得表达,为人源化单链抗体(ScFv)在卵巢癌的诊断与治疗的应用提供实验基础。方法:用TRIZOL法自卵巢癌患者的淋巴细胞中提取RNA,利用SOEingPCR方法分别获得VH、VL基因,构建真核表达载体pPICZα/ScFv。电转化毕赤酵母菌株X-33。用PCR法筛选转染阳性克隆,SDS-PAGE法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的ScFv的表达,筛选高表达工程菌。结果:构建ScFv基因,VH与VL连接后得到700bp左右的条带,ScFv基因在毕赤酵母中获得表达,在26000处出现目的条带。结论:获得ScFv基因及其真核表达载体以及高效表达ScFv的毕赤酵母工程菌。
- 许天敏崔满华谷丽萍王丁丁苏曼曼王文加张赢予焦平
- 关键词：卵巢肿瘤单链抗体毕赤酵母
- P253R突变型FGFR2Ⅲc胞外段的表达、复性及活性研究(英文)
- 2011年
- 成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)具有促进细胞增殖,诱导新生血管形成等重要生理作用,与肿瘤的发生及发展也有十分密切的关系。P253R是Apert综合症中发现的一种突变,可使FGFR2IIIc与FGF2亲和力大大增加,从而导致过度自分泌和旁分泌活性,引起骨骼发育异常。从人胎盘组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到野生型FGFR2IIIc胞外段基因片段(wsFGFR2);再利用重叠延伸法以wsFGFR2基因片段为模板扩增得到P253R突变型FGFR2IIIc胞外段基因片段(msFGFR2,P253R是Apert综合征中发现的一种突变,可使FGFR2与FGF2亲和力大大增加)。msFGFR2基因克隆到pET3c载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式表达。经凝胶层析复性和肝素亲和层析纯化得到复性成功的活性蛋白,复性率为12%,纯度大于95%。MTT结果表明,msFGFR2能显著抑制FGF2促NIH3T3细胞增殖能力,并抑制前列腺癌DU145细胞的增殖,提示msFGFR2能有效阻断FGFs的细胞内信号通路,具有很好的产业化和临床应用前景。
- 刘雪婷喻志红何水连陈安安王丁丁何颖张志成汪炬
- 关键词：包涵体复性
- Hela细胞诱导下TCR Vβ基因的选择性表达与重排研究被引量：3
- 2011年
- 目的研究Hela细胞诱导下T细胞受体(Tcell receptor,TCR)Vβ亚家族基因的优势表达规律,并探讨其是否与重排激活基因(RAGs)介导的TCR重排相关。方法将Hela细胞与健康人外周血单个核细胞(PBMC)混合培养,利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测共培养前后TCRVβ各亚家族基因、重排激活酶RAGs、非同源末端连接(non-homogousend joining,NHEJ)途径中的核心蛋白Ku70/Ku80及末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)等的表达特点。结果随着混合培养时间的推移,TCRVβ各亚家族基因由最初的全部表达逐渐转变为选择性的部分表达,其中,TCRVβ7在各时间段都有明显的表达;Ku70随着培养时间的推移表达量逐渐减少直至没有表达;而RAGs、ku80和TdT基因在各个时间段均未检测到其表达。结论在Hela细胞诱导下,TCRVβ各亚家族基因的表达有一定的选择性但无明显的特异性,该选择性表达可能与RAGs介导的二次重排无关。
- 胡丽莉余雪松王丁丁张凤兰张国锋黄树林
- 关键词：TCRVΒ基因重排
- 应用毕赤酵母分泌表达筛选人抗狂犬病毒抗体scFv-Fc被引量：5
- 2007年
- 目的:利用毕赤酵母人抗狂犬病毒抗体分泌表达文库获得具特异性狂犬病毒抗原结合活性的分泌型小分子抗体(scFv-Fc)。方法:RT-PCR方法扩增获得一组轻链和重链可变区基因。利用重叠延伸PCR方法组装scFv基因后克隆入毕赤酵母scFv-Fc抗体库通用表达质粒pPICZα/Fc后,电转化X33酵母菌,甲醇诱导表达后进行ELISA筛选、基因序列分析及免疫印迹分析。结果:构建了抗狂犬病毒毕赤酵母分泌型scFv-Fc库,获得了12株阳性菌株。对其中2株阳性克隆进行了序列分析证实为新的抗体可变区基因。ELISA、Western blotting分析,证实该scFv-Fc具有特异性狂犬病毒抗原结合活性,相对分子质量为56 000。结论:通过毕赤酵母人抗狂犬病毒抗体scFv-Fc分泌表达文库筛选获得具较高亲和力的新scFv-Fc抗体。
- 王丁丁许天敏余丽江苏曼曼黄树林宿晓云陈磊颜炜群
- 关键词：毕赤酵母狂犬病病毒分泌表达
- 缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导骨形成被引量：11
- 2011年
- 背景:重组人骨形态发生蛋白2在体内半衰期短、易降解代谢,达不到理想的骨再生效果。目的:制备缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料,并观察其缓释性能、骨诱导活性。方法:将重组人骨形态发生蛋白2与壳聚糖混合制备壳聚糖膜,涂覆于生物骨修复材料表面,ELISA方法检测其体外释药性能。茜素红染色检测缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料、单纯骨填充材料诱导C2C12细胞骨钙蛋白的形成,观察其诱导成骨细胞能力。同时将3种骨修复材料植入清洁级KM小鼠股部肌袋内,2周后检测新生骨Ca2+离子含量,评价其异位骨诱导能力。结果与结论:材料表面的壳聚糖膜分布均匀,负载的重组人骨形态发生蛋白2呈团簇状。重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料体外释药存在突释,前4d释放量达总药量的50%,持续至12d,释药量达到90%,第18天时释放完全。与单纯骨填充材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料相比,缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导C2C12细胞向成骨晚期分化能力与异位骨形成能力显著增强(P<0.05)。结果提示缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料缓释性能好,促进骨形成能力强。
- 王丁丁曾戎杨敏儿何鉴贤陈阳何水连陈安安周智优袁丽颖汪炬
- 关键词：人骨形态发生蛋白2壳聚糖缓释骨修复材料骨形成
