王晓
- 作品数：5 被引量：9H指数：2
- 供职机构：江苏大学临床医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国博士后科学基金江苏省普通高校研究生科研创新计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 弓形虫入侵的宿主细胞骨架重塑触发线粒体重新分布被引量：3
- 2015年
- 目的探讨宿主细胞骨架重塑在弓形虫侵入HFF细胞以及触发细胞线粒体重新分布中的作用。方法体外培养HFF细胞,预先用1μg/mL细胞松驰素D(CD)处理30min,接种弓形虫速殖子分别培养1h和20h,Western blotting检测弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)1蛋白表达。同时用MitoTrackerRed CMXRos荧光探针标记细胞线粒体,激光共聚焦显微镜下观察HFF细胞线粒体在弓形虫侵入前后和CD处理前后聚集和分布情况。结果感染后1h,CD处理组HFF细胞内虫体量与CD未处理组差异不大,20h时CD未处理组细胞内虫体量显著多于CD处理组。此时可见HFF细胞线粒体明显聚集成明亮点状且分布于纳虫泡周围,而未感染组细胞线粒体未见明显聚集分布。CD可以显著抑制弓形虫侵入HFF细胞后引起的线粒体聚集。结论触发宿主细胞骨架重塑是弓形虫侵入宿主细胞并引起细胞线粒体向纳虫泡聚集所必须的。
- 吴亮王晓苏丹华刘原付涛姜旭淦陈盛霞曹建平
- 关键词：弓形虫
- 弓形虫表面抗原1、棒状体蛋白18真核表达载体的构建与体外表达被引量：1
- 2015年
- 目的:构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)及棒状体蛋白18(rhoptry protein 18,ROP18)的真核表达重组质粒,并在真核细胞中表达目的蛋白。方法:设计SAG1、ROP18的特异引物,采用RCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码SAG1、ROP18基因片段,经克隆至p TG19-T载体后,亚克隆至真核表达载体p3×FLAG-Myc-CMVTM-24,构建真核表达重组质粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-MycCMVTM-24-ROP18。将构建好的真核表达重组质粒转染人肾上皮细胞系293-T细胞,分析转染细胞的表达情况。结果:PCR扩增弓形虫SAG1和ROP18基因片段分别为1 011 bp和1 665 bp,与预期大小相符。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定结果均正确,通过RT-PCR和蛋白质印迹技术鉴定出重组质粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18在293-T细胞中表达。结论:成功构建了真核表达质粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白。
- 吴腊梅吴婷吴亮王晓苏丹华刘原陶思佳魏逸青姜旭淦陈盛霞曹建平
- 关键词：刚地弓形虫SAG1真核表达质粒
- Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究被引量：2
- 2015年
- 目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒ps PAX2(4μg)和p MD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光。于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞。以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况。结果 PCR扩增rop18片段为960 bp,与预期大小一致。经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功。转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光。经DOX诱导24 h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致。结论采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株。
- 王晓朱君吴亮吴腊梅刘原苏丹华丁宁赵康容姜旭淦陈盛霞曹建平
- 关键词：刚地弓形虫慢病毒
- 用四环素诱导调控表达系统构建弓形虫脂肪酸合成酶FABZ缺陷株被引量：2
- 2014年
- 目的构建基于四环素诱导调控表达系统的刚地弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)缺陷株。方法从弓形虫基因组中扩增fabz基因并构建四环素调控诱导表达载体pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR,电穿孔法导入弓形虫TATi株,通过乙胺嘧啶抗性和极限稀释法筛选FABZ缺陷株,蛋白质印迹(Western blotting)检测虫体内附加表位标签Ty的表达。在5×105个FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素(终浓度为1μg/ml),Western blotting检测带有Ty标签的FABZ表达情况。结果筛选获得的缺陷株可表达带有Ty标签的转运肽型FABZ和成熟型FABZ。FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素24 h和48 h后,转运肽型FABZ表达量均较对照组显著降低(P<0.05)。结论构建了由脱水四环素调控表达的弓形虫FABZ缺陷株。
- 吴亮薛兰兰王晓吴腊梅姜旭淦陈盛霞
- 关键词：刚地弓形虫
- 弓形虫速殖子感染对HeLa细胞凋亡的影响被引量：1
- 2014年
- 目的:探讨不同数量弓形虫速殖子感染对HeLa细胞凋亡的影响。方法:24孔板培养HeLa细胞16 h,各孔接种不同数量弓形虫速殖子继续培养4 h,在培养液中加入终质量浓度为0.5μg/mL放线菌素D诱导凋亡,于加放线菌素D后8、12、24、36 h收集细胞,采用Hoechst 33258染色法和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。结果:当虫体量/细胞量(MOI)≤1时,弓形虫感染表现为抑制放线菌素D诱导的HeLa细胞凋亡;随着虫体数量增加(MOI>1)和感染时间延长(≥24 h),虫体感染则表现为促进HeLa细胞凋亡。结论:弓形虫感染可影响体外培养的HeLa细胞的凋亡,影响程度与感染虫体数量相关。
- 沈进陈颖婷吴亮吴腊梅王晓陈盛霞曹建平
- 关键词：刚地弓形虫细胞凋亡HELA细胞放线菌素D
