郝俊莹
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
- 供职机构：中国医科大学药学院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
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- FANCF-shRNA表达质粒的构建及MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染细胞模型的建立
- 2011年
- 目的构建针对人FANCF基因的shRNA表达质粒(FANCF-shRNA),转染FANCF-shRNA使人乳腺癌MCF-7细胞FANCF基因沉默,从而建立MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染细胞模型。方法实验分两部分:FANCF-shRNA表达质粒的构建:根据相关文献报道,使用Ambion公司的在线设计软件,设计并合成能够编码针对FANCF基因的小发夹RNA(FANCF-shRNA)的DNA模板,将其插入到p SliencerTM 4.1-CMV neo表达质粒中,形成pSliencerTM 4.1-CMV-FANCF-shRNA重组质粒;将该重组质粒转化到E coli感受态细胞JM109中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增;通过PCR及基因测序方法筛选出插入正确的FANCF-shRNA表达质粒;MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染细胞模型的建立:碱裂解法提取FANCF-shRNA表达质粒,通过脂质体介导将该质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞中,RT-PCR法检测FANCF基因mRNA表达水平,确认FANCF基因沉默。结果含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR扩增片段约为250 bp,并且其基因测序结果显示插入片段碱基排列顺序正确,没有突变,说明FANCF-shRNA表达质粒构建成功;与阴性对照组相比,转染FANCF-shRNA质粒后第2天、第3天、第5天和第7天,FANCF基因mRNA表达水平均明显减低,表达抑制率分别为(36.51±6.84)%、(37.03±6.61)%、(53.03±9.33)%和(39.51±10.13)%(P<0.05),说明FANCF基因沉默,MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染成功建立。结论成功构建了FANCF-shRNA表达质粒并建立MCF-7-FANCF-RNAi细胞模型,为研究FANCF基因在乳腺癌发生发展及耐药产生与调控中的作用奠定实验基础。
- 唐宏涛何苗李娜孙海刚余涧坤郝俊莹魏敏杰
- 关键词：人乳腺癌MCF-7细胞RNAI
- FANCF-shRNA质粒构建及其对卵巢癌细胞OVCAR3沉默效应的观察被引量：3
- 2011年
- 目的:构建针对人FANCF基因的特异性shRNA真核表达载体,体外观察siRNA对卵巢癌OVCAR3细胞系FANCF基因的沉默效应。方法:采用基因克隆技术,将设计合成的能表达短发夹RNA的寡核苷酸序列插入真核表达质粒载体pSilencerTM4.1-CMV-neo,构建能表达FANCF-shRNA的真核表达载体;转染人卵巢癌OVCAR3细胞,提取总RNA和蛋白,RT-PCR验证mRNA表达的变化,蛋白质印迹法验证蛋白表达的变化。结果:质粒酶切和测序证实成功构建了FANCF-shRNA的真核表达载体。与野生型OVCAR3相比,脂质体法转染卵巢癌OVCAR3细胞后,FANCFmRNA 24、48和72 h的表达水平与阴性控制组比较均下调,抑制率分别为(23.91±6.58)%(、51.23±5.86)%和(47.42±7.52)%;FANCF蛋白在244、8和72 h的表达水平与阴性控制组比较亦下调,抑制率分别为(16.28±5.46)%(、24.42±6.85)%和(36.05±8.26)%。证实FANCF-shRNA具有沉默OVCAR3细胞FANCF基因表达的效应。结论:siRNA-FANCF干扰可引起卵巢癌OVCAR3细胞系FANCF基因沉默,可能为卵巢肿瘤基础和临床研究提供一种有效的方法。
- 郝俊莹孙海刚李娜余涧坤唐宏涛李艳琳于兆进赵琳何苗魏敏杰
- 关键词：FANCF
- 干预FANCF基因对人卵巢癌OVCAR3细胞生物学特性的影响
- 前言：FANCF作为FA/BRCA通路的重要调控蛋白,参与正常细胞DNA修复、细胞周期与凋亡调控、解毒功能调节、生命信号转导等。如果FA/BRCA通路受损会导致细胞染色体不稳定以及对DNA损伤剂高度敏感。FA复合体的稳定...
- 郝俊莹
- 关键词：人卵巢癌RNA干扰肿瘤发生发展
- 文献传递
