陈袁
- 作品数：7 被引量：4H指数：1
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- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立
- 2017年
- 目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的相关研究奠定基础。方法:以PEF细胞c DNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段(RLD),最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体p TRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果:扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1(975bp)、LIN28(727bp)和DPPA5(408bp),并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,最终构建了3个表达载体(p TRE3G-Zs-OCT4、p TRE3G-Zs-TBX3、p TRE3G-Zs-RLD),且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与p EF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论:成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。
- 张曼玲陈袁赵丽华李艳如金永王俊政姜海滨陈俏羽李荣凤
- 关键词：IPS细胞
- 建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系被引量：1
- 2016年
- 目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(i PS细胞)。方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体p CAG-p LIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-p LIF细胞)。通过RT-PCR、q PCR、Western blot等方法检测STO-p LIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-p LIF细胞作为饲养层,培养大鼠i PS细胞。通过生长曲线检测、碱性磷酸酶染色、干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-p LIF细胞饲养层在大鼠i PS细胞培养方面的功能。结果:STO-p LIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P<0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠i PS细胞在形态、多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠i PS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠i PS存在差异(P<0.05)。结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-p LIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠i PS细胞培养中具有一定优势。
- 陈袁赵丽华杨宁张曼玲金永侯道荣吴兆强李艳如姜海滨李荣凤
- 关键词：饲养层细胞
- 猪naive-like诱导性多能干细胞系的建立及红色荧光蛋白标记被引量：1
- 2017年
- 目的 :建立猪naive-like诱导性多能干(induced pluripotent stem,i PS)细胞系,并对其进行红色荧光标记,为通过示踪猪naive i PS细胞发育和分化的相关研究奠定基础。方法:首先利用核转染技术向巴马小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)中转入鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子表达载体Tet O-FUW-OSKM,并同时转入激活表达载体FUW-M2rt TA,采用白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)的培养体系进行培养,通过在培养液中添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)进行诱导,建立起猪i PS细胞系,并对细胞系的多能性进行鉴定。在此基础上,向i PS细胞系转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行标记,并鉴定被红色荧光标记后的细胞是否仍然具有多能性。结果:所建立的i PS细胞系克隆呈三维立体生长,可以进行单细胞传代培养至30代以上,核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达多种干细胞多能因子,利用LIF/STAT3信号通路维持其增殖,体外可分化形成表达三胚层相关基因的类胚体,为猪naive-like i PS细胞系。成功对所建立的i PS细胞系进行红色荧光标记,碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色结果显示被红色荧光标记的i PS细胞的多能性依然存在。结论:成功建立了稳定表达红色荧光蛋白的猪naive-like i PS细胞系。
- 姜海滨张曼玲赵丽华金永陈袁王俊政陈俏羽李荣凤
- 关键词：多能性红色荧光蛋白
- 猪胚胎来源干细胞建系方法的初步研究
- 哺乳动物胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）和滋养层干细胞(trophoblast stem cells，TSC)均属于胚胎来源的干细胞，由早期胚胎或内细胞团(inner cell mass，I...
- 陈袁
- 关键词：细胞培养胚胎干细胞白血病抑制因子
- 核转染技术转染大鼠胚胎干细胞的初步研究
- 2015年
- 大鼠胚胎干细胞(rat embryonic stem cells,r ESCs)的基因转染研究仍处于探索阶段。该文利用不同的核转染条件,将红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)表达载体p EF1alphaDs Red-Express2导入大鼠胚胎干细胞中,比较不同转染条件下大鼠胚胎干细胞的红荧光蛋白表达效率和死亡率,确定最佳核转染条件。在采用最佳核转染条件转染大鼠胚胎干细胞后,利用碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光染色等方法,比较核转染前后大鼠胚胎干细胞的干细胞特性,探讨核转染过程对大鼠胚胎干细胞的干细胞特性的影响。实验结果显示,转染条件为A-13时,可获得最好的大鼠胚胎干细胞转染效率(39.63±1.75)%。核转染后,表达红色荧光蛋白的大鼠胚胎干细胞的碱性磷酸酶染色结果仍为阳性。另外,RT-PCR和免疫荧光染色结果表明,核转染前后大鼠胚胎干细胞的干细胞多能性标志基因的表达情况未出现明显差异。研究表明,核转染条件A-13可以在不改变大鼠胚胎干细胞特性的条件下有效地对其进行基因转染,即核转染技术适用于大鼠胚胎干细胞的基因转染。
- 吴兆强赵丽华张曼玲金永聂晓伟侯道荣杨宁陈袁李荣凤
- 关键词：红色荧光蛋白
- miRNA-205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能干细胞建系的作用被引量：1
- 2018年
- 目的:构建miRNA-205过表达载体并研究miRNA-205对猪诱导多能干细胞系建立的影响。方法:对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪内细胞团细胞及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行miRNA表达谱的分析比较,利用PCR扩增miRNA-205前体序列,并将其克隆于基础表达载体p CAGDNA3-h Fat1,构建过表达载体p CAG-miR205。使用脂质体转染技术将该载体转染到已转基因修饰的猪胎儿成纤维细胞(含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)。利用干细胞培养液诱导培养建立猪诱导性多能干细胞系。通过实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miRNA-205的表达情况,比较分析miRNA-205对猪诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果:成功构建了p CAG-miR205过表达载体;相较于未转染细胞,转染该载体细胞的miRNA-205表达量显著升高(P<0.01);利用干细胞培养液诱导后培养转染组的诱导性多能干细胞克隆长出率高于未转染细胞组。结论:研究结果表明在细胞水平上过表达micro RNA-205,可提高猪诱导性多能干细胞建系效率;已构建的miRNA-205过表达载体将有助于在后续研究中建立稳定表达miRNA-205的细胞系,为进一步深入研究miRNA-205在干细胞重编程和多能性维持中的作用机制打下基础。
- 陈俏羽赵丽华陈袁张曼玲侯道荣姜海滨王俊政刘曼菱王晨宇尤志欢李荣凤
- 关键词：诱导多能干细胞
- 建立高效表达猪LIF的猪胚胎成纤维细胞系被引量：1
- 2015年
- 该文目的是建立高效表达重组猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的猪胚胎成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)系PEF-p LIF,为下一步辅助建立和培养猪nave胚胎干细胞奠定基础。以猪胚胎成纤维细胞的总RNA为模板,利用RT-PCR的方法扩增猪白血病抑制因子基因(LIF),将LIF c DNA连接到真核表达载体p CAGDNA3的启动子下游,构建LIF基因真核表达载体p CAGDNA3-p LIF;利用核转染的方法将p CAGDNA3-p LIF质粒转入PEF;对转染细胞进行G418筛选,得到稳定高效表达重组猪LIF的PEF-p LIF;利用RT-PCR、Western blot鉴定PEF-p LIF中LIF基因及LIF表达情况;使用PEF-p LIF细胞作为饲养层培养小鼠胚胎干细胞,通过对小鼠胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色及细胞免疫荧光染色,对PEF-p LIF维持干细胞干性功能进行初步验证。实验结果显示,成功构建了真核表达载体p CAGDNA3-p LIF;并将其成功转入PEF中,获得高效表达重组猪LIF的PEF-p LIF;以PEF-p LIF作为饲养层成功培养克隆形态正常的小鼠胚胎干细胞。该研究表明,稳定高效表达重组猪LIF蛋白的猪胚胎成纤维细胞系PEF-p LIF可作为饲养层维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态,可为下一步建立及培养猪nave胚胎干细胞提供条件。
- 杨宁赵丽华张曼玲金永侯道荣吴兆强陈袁李荣凤
- 关键词：饲养层细胞小鼠胚胎干细胞
