刘晓云
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
- 供职机构：华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中央高校基本科研业务费专项资金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：理学生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- ^(13)C辅助的超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度被引量：2
- 2016年
- 毕赤酵母作为一种高效的外源蛋白表达平台,其蛋白表达水平与胞内代谢物浓度紧密相关。但胞内代谢物种类多、物化性质差异大、浓度低、周转快,对其绝对浓度的精确检测一直难于实现。本研究将超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用分析方法与13C同位素标记技术相结合,探索解决该难题的方法。首先,优化了超高效液相色谱的操作条件,利用3种色谱柱实现了64种常见中间代谢物的分离;对三重四极杆质谱仪的检测离子对和碰撞电压等操作条件进行优化,找到了对各种物质具有专一性的检测离子对。然后,利用全标记13C标记底物培养细胞,收集胞内的全标记代谢物用作定量内标物,建立了53种中间代谢物的标准曲线。实验结果表明,本方法不但精确性高,标准曲线相关系数达到0.99以上,而且重现性好,受实验条件和仪器操作条件的影响很小。将本方法应用于毕赤酵母胞内代谢物浓度的绝对定量分析,成功获得了胞内各种代谢物的浓度水平,为后续深入研究毕赤酵母代谢调控机理,实现外源蛋白的高效生产奠定了基础。
- 郭孟磊刘晓云黄明志李敏超储炬庄英萍张嗣良
- 关键词：代谢物浓度毕赤酵母
- 基于葡萄糖脉冲的同位素稀释质谱检测法标品制备
- 2017年
- 同位素稀释质谱检测法(IDMS)是目前进行胞内代谢物浓度高通量检测精度最高的一种方法,这个方法的关键就是制备待检测代谢物对应的^(13)C全标记的标品。传统制备^(13)C全标记标品的方法是采用批培养的模式获取,但该方法所制备的胞内代谢物浓度通常较低。通过以^(13)C全位标记葡萄糖作为唯一碳源培养毕赤酵母G/DSEL菌种,采用^(13)C全位标记葡萄糖脉冲刺激法,结合快速取样淬灭方法的新方法,成功制备了带^(13)C标记标品并提高了其浓度。经液质联用(LC-MS)与气质联用(GC-MS)结果分析,与传统制备方法相比,胞内大部分有机酸、磷酸糖、氨基酸和核苷酸类物质的浓度实现了约2–10倍的提高。因此底物脉冲法可以有效提高^(13)C全标葡萄糖的单位利用率,并能实现对胞内部分含量低于仪器检测限的代谢物的检测。
- 舒威李超刘晓云夏建业庄英萍
- 关键词：液质联用气质联用
- 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用检测红色糖多孢菌胞内中间代谢物同位素丰度
- 2017年
- 采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(LC-MS/MS),建立了能精确检测红色糖多孢菌胞内代谢物^(13)C同位素丰度的方法。在优化的超高效液相色谱的条件及三重四极杆串联质谱的离子传输电压和碰撞池电压下,筛选出各胞内代谢物的最佳离子对。根据物质在LC-MS/MS中生成的母离子和子离子碳链长短及子离子是否含有^(13)C等特性,建立了"一对一"法、"一对多"法和单级质谱SIM法等同位素丰度检测方法。利用这些方法,检测了自然标记标准品和^(13)C标记实验样品,根据实验值与理论值的接近程度筛选出最优方法。结果表明,对于以磷酸糖类为代表的子离子不含有^(13)C的代谢物,"一对一"法最有效;对于以有机酸类为代表的母离子和子离子都含有^(13)C的短碳链代谢物,"一对多"法更有优势;对于以辅酶A类为代表的母离子和子离子都含有^(13)C且碳链较长的代谢物,单级质谱SIM法才能发挥作用。建立的同位素丰度检测方法具有较好的准确度,可应用于红色糖多孢菌胞内代谢物同位素丰度的检测,为后续研究菌体的代谢机理,实现红霉素的高效表达奠定了基础。
- 牟翰洪铭刘晓云李敏超黄明志储炬庄英萍张嗣良
- 关键词：红色糖多孢菌
