周丽英
- 作品数：12 被引量：20H指数：3
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市自然科学基金北京市科技新星计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 带myc标签的人造血相关PBX相互作用蛋白真核表达载体的构建及其功能研究被引量：1
- 2014年
- 目的:构建带myc标签的造血相关PBX相互作用蛋白(HPIP)的真核表达载体,获得myc-HPIP融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的pcDNA3.0-HPIP质粒为模板,采用PCR技术扩增HPIP编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,通过Western印迹检测表达情况;将重组质粒与空载体分别转染人肝癌HepG2细胞,通过Western印迹检测其对AKT、ERK信号通路中AKT、ERK磷酸化水平的影响。结果:双酶切和测序结果表明myc-HPIP真核表达质粒构建成功,转染HepG2细胞后表达了myc-HPIP融合蛋白;Western印迹证明myc-HPIP可升高AKT、ERK的磷酸化水平。结论:构建了带myc标签的人HPIP真核表达载体,为进一步研究HPIP在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。
- 李玲闫志风蒋昊冯滢滢冀全博黄蓉周丽英王鹏徐小洁叶棋浓
- 关键词：真核表达
- 人CDK7基因真核表达载体的构建与鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的构建带Myc标签的细胞周期蛋白依赖性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7)的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶与已知相互作用蛋白P53之间的相互作用。方法应用PCR技术从人乳腺文库中扩增出CDK7全长编码区基因,将其克隆到p XJ-40载体中;继而重组质粒转染人胚肾293T细胞,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达情况;免疫共沉淀检测Myc-CDK7与FLAG-p53的相互作用。结果双酶切和基因测序鉴定显示,Myc-CDK7真核表达质粒克隆构建成功;SDS-PAGE和Western印迹结果表明,Myc-CDK7转染人胚肾293T细胞后成功表达;免疫共沉淀显示,重组Myc-CDK7与已知相互作用蛋白P53在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论成功构建Myc-CDK7的真核表达载体,为进一步探讨Myc-CDK7对细胞周期的调控奠定了实验基础。
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- 关键词：细胞周期蛋白质依赖激酶类真核表达
- 人VHL基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的抑制被引量：2
- 2014年
- 目的:构建人抑癌基因VHL的真核表达载体,并验证其对肿瘤细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人VHL基因,将其克隆到p XJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后转染人胚肾293T细胞,通过蛋白免疫印迹鉴定其表达;转染人乳腺癌ZR75-1细胞和肝癌Hep G2细胞,通过CCK8法测定细胞生长曲线。结果:从人乳腺文库中扩增得到约650 bp的DNA片段,并克隆至p XJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,蛋白免疫印迹检测到相对分子质量为26×103的目的基因表达产物;细胞生长曲线显示,转染myc-VHL的乳腺癌、肝癌细胞较空载体细胞生长慢。结论:构建了myc-VHL真核表达载体,myc-VHL抑制癌细胞生长,为进一步研究VHL在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。
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- 关键词：克隆真核表达肿瘤细胞
- 人细胞周期蛋白H基因的真核表达载体构建和表达及功能检测被引量：1
- 2014年
- 细胞周期蛋白H（cyclin H）是一种含323个氨基酸,相对分子质量（Mr）为38 000的细胞周期调控蛋白,普遍存在于真核细胞中,可与细胞周期蛋白依赖性激酶7（cyclin-dependent kinase 7,CDK7）共同参与细胞周期和基因转录的合理调控,其复合体可以催化各种CDK分子的活化,从而影响细胞增殖。
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- 关键词：真核表达
- BRCA1基因真核表达载体的构建及其功能验证
- 2014年
- 目的构建人乳腺癌易感基因BRCA1的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人BRCA1基因,将其克隆到p XJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后转染到乳腺癌ZR75-1细胞中,通过Western印迹检测其表达情况,并用CCK8法测定细胞生长曲线。结果从人乳腺文库中扩增获得大小为5600 bp的DNA片段,并成功克隆至p XJ-40-myc载体上,经测序与目的序列完全一致;转染乳腺癌ZR75-1细胞后目的基因成功表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-BRCA1的乳腺癌细胞较空载体细胞生长缓慢;划痕实验说明,转染myc-BRCA1的乳腺癌细胞较空载体细胞迁袭缓慢。结论成功构建了带myc标签的人BRCA1真核表达载体,为进一步研究BRCA1在乳腺癌发生发展中的功能奠定了基础。
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- 关键词：克隆真核表达乳腺肿瘤
- 人FOXO3a基因真核表达载体的构建及其功能验证被引量：1
- 2014年
- 目的:构建带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,并对其功能进行初步检测。方法:采用PCR技术,从乳腺文库中扩增人FOXO3a基因,并将其正确插入pXJ-40-myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人乳腺癌细胞系ZR75-1、MCF-7后,通过Western印迹检测其表达情况,并用CCK8法测定细胞生长曲线。结果:双酶切和测序鉴定表明myc-FOXO3a真核表达质粒构建成功,转染乳腺癌ZR75-1、MCF-7细胞后目的基因成功表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-FOXO3a的乳腺癌细胞较空载体细胞生长较慢。结论:构建了带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,为进一步研究FOXO3a在乳腺癌中的功能奠定了基础。
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- 关键词：克隆真核表达
- myc-cyclin B1重组基因的克隆表达和细胞内定位
- 2014年
- 细胞周期蛋白B1（cyclin B1）是调控细胞由G2期向M期转换的重要因子之一, G2末期cyclin B1的表达达到高峰。激活细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase 2, CDK2）, 形成cyclin B1/CDK2复合物, 进入细胞核, 裂解一系列底物蛋白, 推动细胞从DNA合成期进入有丝分裂。肿瘤细胞的永生化与细胞周期的调控失常有密切关系, 并且发现, 作为一种细胞周期调节因子, cyclin B1与肿瘤有着非常密切的关系, 它是与肿瘤有直接关系的癌基因之一[1-2]。Cyclin B1[3]在许多癌细胞中均存在高表达[4-5], 如在卵巢癌、胃肠癌、宫颈癌和膀胱移行细胞癌中。在细胞周期G2/M起正性调控作用, 启动有丝分裂, cyclin B1高表达使细胞周期紊乱, 促进肿瘤的发生[6-7]。使用抗癌药可以降低cyclin B1表达, 细胞周期阻滞在G2/M期[8]。本实验拟构建cyclin B1的真核表达载体, 并验证其在细胞内的定位情况, 为进一步研究cyclin B1与肿瘤的关系奠定了实验基础。
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- 关键词：克隆真核表达
- 人ATG4B的表达及蛋白纯化和鉴定被引量：4
- 2015年
- 目的构建含His标签的自噬相关蛋白4同源物B(ATG4B)重组质粒以得到His-ATG4B蛋白,初步鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出ATG4B基因的编码序列,插入p ET-28a(+)载体中得到重组质粒,经酶切鉴定后转化Rossate菌,挑选小量诱导出的His-ATG4B菌液进行His-ATG4B蛋白的纯化,SDS-PAGE和Western blot法检测His-ATG4B蛋白的纯化效果,GST pull-down技术对蛋白生物学功能进行鉴定。结果用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到大小约1100 bp的目的片段,插入p ET-28a(+)载体中构建出His-ATG4B重组质粒,酶切鉴定及测序结果均表明His-ATG4B质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化蛋白,得到相对分子质量(Mr)约为47 000的His-ATG4B蛋白,且SDS-PAGE检测蛋白纯化效果较好;GST pull-down实验证实His-ATG4B蛋白可以和LC3B蛋白在体外相互作用,生物学活性良好。结论本实验成功得到His-ATG4B蛋白,为研究ATG4B在自噬中的作用机制奠定实验基础。
- 黄蓉徐小洁梁迎春张立王涛周丽英杜楠叶棋浓
- 关键词：原核表达纯化自噬
- 人Six1真核表达载体的构建及应用被引量：3
- 2015年
- Six1（sineoculis homeobox homolog 1,Six1）是一种转录调控因子,属于同源盒基因家族成员,是转录因子E2F1的转录靶基因,激活G1/S期的转录,增加S期转录水平,并通过激活靶基因如细胞周期蛋白A1（cyclin A1）、cyclin D1等,启动靶基因转录,从而抑制与DNA结合能力,最后被蛋白酶水解[1]。当Six1过表达时,这一作用则被削弱,
- 周丽英徐小洁李玲王涛张立范忠义郑志兵叶棋浓
- 关键词：真核表达载体绿色荧光蛋白
- 人自噬相关基因LC3B原核表达载体的构建及活性检测被引量：9
- 2014年
- 目的构建带GST标签的人LC3B基因原核表达载体,得到GST-LC3B重组质粒并纯化出GST-LC3B融合蛋白,体外检测并证实该蛋白的生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出LC3B基因的编码序列,将该序列插入到p GEX-KG载体中,得到GST-LC3B重组质粒,转化大肠杆菌Rossate,经小量诱导后利用GSTSepharose 4B亲和珠纯化GST-LC3B融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western印迹方法进行检测,GST pull-down技术证实其生物学活性。结果利用PCR技术从人乳腺文库中成功扩增得到大小约400 bp的目的基因片段,插入p GEX-KG载体中得到GST-LC3B质粒,经双酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量(Mr)约为40×103的目的蛋白;GST pull-down技术检测出GST-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白在体外作用,具有较好的生物学活性。结论成功构建了人自噬相关基因LC3B的原核表达产物,为进一步研究LC3B在自噬中的作用机制奠定了基础。
- 黄蓉徐小洁梁迎春王涛冯滢滢周丽英李玲冀全博郭靖叶棋浓杜楠
- 关键词：原核表达自噬
