陈学秋
- 作品数：55 被引量：45H指数：4
- 供职机构：浙江大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省重大科技专项基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学环境科学与工程更多>>
- 捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定被引量：2
- 2017年
- 【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L^(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L^(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1) MgCl_2,60μmol·L^(-1)CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L^(-1)的反应体系(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1)MgCl_2,60μmol·L^(-1) CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.
- 郑秀平丁豪杰郭筱璐杨怡黄艳陈学秋周前进杜爱芳
- 关键词：捻转血矛线虫原核表达酶活测定
- 华支睾吸虫间接ELISA检测方法的建立及初步应用被引量：3
- 2015年
- RT-PCR扩增华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的Enolase基因后,进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物;以纯化后的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对工作条件进行优化。结果表明,ELISA最佳工作条件为:抗原最佳包被质量浓度为5mg/L,37℃1h再4℃过夜;5%脱脂奶粉,37℃封闭1h;待检血清1∶100稀释37℃孵育1h;酶标二抗1∶5 000稀释,37℃孵育45min;TMB显色作用时间10min;确定的阴阳性血清临界值为0.253。所建立的ELISA方法特异性较好,可检测犬华支睾吸虫病阳性血清,与犬卫氏并殖吸虫病阳性血清、犬蛔虫病阳性血清、犬弓形虫病阳性血清、犬新孢子虫病阳性血清均不发生反应。该方法敏感性为1∶3 200。批间批内重复性试验变异系数均小于10%。在临床应用中,对浙江地区353多份犬血清的检测表明,样品阳性率为1.13%。本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床病例的血清学快速检测,为华支睾吸虫的血清流行病学调查提供了有效手段。
- 潘辰杨怡陈学秋杜爱芳
- 关键词：华支睾吸虫间接ELISA
- 检测猪弓形虫ROP14抗体间接ELISA方法的建立被引量：2
- 2020年
- 为丰富和完善弓形虫病的检测方法,本试验基于弓形虫棒状体蛋白14(TgROP14)建立了间接ELISA检测方法。构建原核表达载体pET30α-ROP14,转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达并纯化获得TgROP14重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot试验验证其纯度及免疫原性。利用纯化透析后复性的rTg-ROP14建立猪弓形虫病间接ELISA检测方法,并对反应中各项条件进行了优化。结果表明最佳检测条件为:抗原包被量2μg/孔,血清稀释倍数为1∶20,封闭剂为5%脱脂奶粉,血清作用时间为60 min,二抗稀释倍数为1∶1 000,二抗作用时间为60 min,TMB作用时间为20 min,临界值为0.728。该方法敏感性为1∶80,批内批间重复试验变异系数均小于10%,重复性较好;使用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征(美洲型)阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清、猪A型口蹄疫阳性血清和猪瘟阳性血清均未见交叉反应,特异性较好。利用该方法对来自浙江省各个地区的436份猪血清样品进行检测,同时使用商品化的间接血凝试剂盒进行验证,符合率为72.7%(317/436)。综上所述,本试验建立的间接ELISA方法可用于临床样品的检测,为猪弓形虫病的血清流行病学调查提供了依据。
- 黄冶川阳毅敏潘灵韬庄浩瀚陈学秋杨怡杜爱芳
- 关键词：弓形虫间接ELISA
- 抗桔青霉毒素单链抗体及其制备方法与应用
- 本发明提供一种抗桔青霉毒素的单链抗体。本发明采用人工偶联抗原桔青霉毒素—BSA/BSA和桔青霉毒素—OVA/OVA抗原组合对抗体-核糖体-mRNA三联体复合体进行亲和筛选，采用原位RT-PCR方法对亲和筛选产物进行回收，...
- 杜爱芳程海卫王素华赵现锋杨怡陈学秋陈一飞
- 文献传递
- 桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法
- 本发明提供一种桔青霉毒素--蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，采用水溶性1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联剂。桔青霉毒素先进行活化，而后与偶联试剂相互反应，...
- 杜爱芳程海卫杨怡陈学秋
- 文献传递
- 鸦胆子对鸡球虫卵囊孢子化率及子孢子的直接杀伤作用被引量：4
- 2018年
- 自苦木科植物鸦胆子中提取了鸦胆子油（BJ—PE）、鸦胆子乙醇萃取物（BJEE）和鸦胆子水提物（BJWE），通过气相色谱一质谱联用技术（GC—MS）检测了鸦胆子油的化学成分，并探讨了鸦胆子提取物对鸡球虫卵囊抱子化的影响及对子孢子的直接杀伤作用。结果显示，通过GC—MS法鉴定出鸦胆子油中含有32种化合物，主要为脂肪酸、脂肪醇类化合物及少量芳香族化合物。鸡球虫卵囊经BJEE、BJ-WE和Bruceine-D处理后，未孢子化率升高，其中8g／LBJ—WE处理组中未孢子化卵囊的数量显著高于对照组（P〈0．05）。子孢子经BJEE和Bruceine—D处理后，数量显著减少，形态发生明显变化，表现出变短、变圆的趋势。透射电镜观察发现，子孢子或萎缩成小球，外膜轮廓模糊，淀粉粒减少；或细胞膜破裂，胞内细胞器排列混乱；或呈现哑铃型，结构扭曲。综上所述，鸦胆子提取物对鸡球虫卵囊的孢子化具有一定的抑制作用，对子孢子具有较强的直接杀伤作用，为抗球虫药物的研发提供了新选择。
- 蓝丽华杨怡左保杏子陈学秋杜爱芳
- 关键词：鸦胆子鸡球虫孢子化率子孢子
- Hc-fau基因结构域功能及Hc-FAU天然融合蛋白现象的初步研究
- 捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)为吸血性寄生虫,能够在L4早期阶段进入滞育状态来躲避不利于自身生存的恶劣条件。本研究旨在研究Hc-fau基因各结构域所发挥的功能以及Hc-FAU天然融合蛋白特性分析...
- 郭筱璐闫宝龙杨怡黄艳丁豪杰郑秀平陈学秋杜爱芳
- 关键词：捻转血矛线虫
- 捻转血矛线虫锌金属蛋白酶NAS-31的表达特性及功能初步研究
- 2021年
- 捻转血矛线虫病由捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生于反刍动物皱胃之中引起。为探究捻转血矛线虫锌金属蛋白酶NAS-31基因(Hc-nas-31)在虫体自由生活时期(特别是3期幼虫)中发挥的功能,本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测目的基因在捻转血矛线虫各发育阶段的转录水平,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)、基因步移及融合PCR方法扩增并分析其基因结构;构建原核表达载体后转化至BL21感受态细胞中进行诱导表达;将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体;通过虫体间接免疫荧光分析Hc-NAS-31在捻转血矛线虫体内的表达特性并预测其功能。结果表明:Hc-nas-31在各时期虫体中均有转录,其中在3期幼虫中的转录水平最高;蛋白质印迹结果显示,制备的抗体能特异性结合Hc-NAS-31天然蛋白;间接免疫荧光分析发现,Hc-NAS-31蛋白主要表达于3期幼虫的上皮细胞合胞体内,在成虫中则分布于肠道、生殖腺(性腺)、肌肉组织及早期虫卵中。本实验明确了NAS-31在捻转血矛线虫中的表达特性,为进一步研究Hc-nas-31的生物学功能奠定了基础。
- 黄艳张惠童丹妮周静茹吴飞陈学秋杨怡马光旭杜爱芳
- 关键词：捻转血矛线虫转录水平
- 鹌鹑常见疫病及防控对策
- 2016年
- 鹌鹑肉和鹌鹑蛋具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点,营养价值高,具有＂动物人参＂的美誉. 早在20世纪,鹌鹑养殖就已成为养殖业热点,目前我国已成为鹌鹑养殖业最发达的国家之一,养殖的商品鹌鹑主要有蛋用型鹌鹑和肉用型鹌鹑,其中蛋用鹌鹑主要有日本鹌鹑、中国白羽鹌鹑、黄羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑、自别雌雄配套系鹌鹑;肉用鹌鹑主要有法国迪法克肉用鹌鹑、中国白羽肉用鹌鹑、法国菲鹌鹑、美国加利福利亚鹌鹑、法拉安肉用鹌鹑、莎维麦脱肉用鹌鹑等.
- 黄艳丁豪杰杨怡陈学秋杜爱芳
- 关键词：鹌鹑蛋防控对策常见疫病自别雌雄配套系肉用鹌鹑低胆固醇
- 捻转血矛线虫三期幼虫抗干燥的差异表达基因的研究
- 陈学秋周前进闫宝龙杨怡张红丽杜爱芳
