何薇薇
- 作品数：8 被引量：27H指数：4
- 供职机构：北京生物制品研究所更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人巨细胞病毒gB基因真核表达载体的构建与鉴定被引量：4
- 2004年
- 目的 克隆人巨细胞病毒 (HCMV)gB基因并构建真核表达载体。方法 根据Genebank中HCMV核苷酸序列设计引物 ,并在引物的 5′端分别加入BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶位点 ,特异性扩增gB编码基因片段。TA克隆后经双酶切、PCR、测序等鉴定重组质粒 ,再经双酶切、连接构建含HCMVgB编码基因的真核表达载体 ,转染COS7细胞 ,通过间接免疫荧光法 (IFA)检测该重组真核表达载体在COS7细胞中的表达。结果 重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成大小为 5 0kb与 2 7kb的片段 ,表明表达载体pcDNA3 1中插入了HCMVgB基因片段 ,测序结果表明读码框正确。重组表达载体pcDNA3 1 gB转染COS7细胞后 ,经IFA检测胞浆中可见黄绿色荧光。结论成功构建了pcDNA3 1 gB真核表达载体 。
- 许丽锋张中洋李秀玲何薇薇
- 关键词：人巨细胞病毒GB基因真核表达载体重组质粒
- 水痘-带状疱疹病毒VZV84-7株全基因序列测定及分析被引量：4
- 2010年
- 目的分析我国自行分离的水痘-带状疱疹病毒疫苗株北京株(VZV84-7株)的全基因序列及特征。方法采用超速离心法获得纯化病毒颗粒,酚-氯仿法抽提病毒基因组DNA后超声破碎,回收1500～3000bp的片段,克隆至质粒pUC18中,构建病毒DNA文库,进行测序及序列分析,并与Dumas野毒株进行比较,绘制种系发育树,分析其与其他株VZV的同源性。结果VZV84-7株基因组全长125083bp,G+C含量为46.1%。基因组各区段长度及G+C含量分别为:UL:104746bp,G+C:44.3%;TRL和IRL:各89bp,G+C:69.7%;Us:5235bp,G+C:42.8%;TRS和IRS:各7462bp,G+C:59.3%。其R2可变区重复单位的拷贝数为7个,R4可变区为9个,R5可变区为1个。VZV84-7株共有71个ORFs,其中3个基因位于重复序列区,位于IRS的ORF69～71与位于TRS的ORF62～64序列完全一致。与Dumas株相比,共有248个核苷酸位置存在差异,大部分突变为单个核苷酸替换,另有部分插入或缺失性突变。其中碱基转换比碱基颠换更常见,发生率分别为66%和34%。种系发育分析结果显示,VZV84-7株与其他株VZV的同源性为95%以上。结论VZV84-7株具有其独特的基因特征,但与其他株VZV具有较高的同源性。
- 李秀玲王潇潇张中洋郝春生张晨何薇薇
- 关键词：水痘-带状疱疹病毒基因
- 肠病毒71型空斑检测方法的建立被引量：4
- 2009年
- 目的建立肠病毒71型(EV71)空斑检测方法,为EV71生物学特性及疫苗的研究提供手段。方法将不同稀释度的5株EV71分别接种至单层RD细胞和Vero细胞,加入甲基纤维素覆盖,计数空斑,并计算病毒滴度。通过3次连续检测,验证空斑法的精密性,并对空斑法与微量细胞病变法检测病毒滴度的结果进行比较。结果采用RD细胞和Vero细胞,通过空斑法对EV71病毒滴度进行检测,96h后均能规律地出现边缘整齐、清晰的空斑,RD细胞和Vero细胞检测的空斑直径分别为1～2mm和0.5～1mm。连续3次重复试验结果显示,试验间变异系数的平均值Vero细胞为2.52%,RD细胞为4.49%。空斑法与微量细胞病变法比较,其检测结果具有良好的线性相关性,相关系数为r=0.972,P=0.006。结论已建立了精密性好、出斑规律的EV71病毒空斑检测方法。
- 郝春生赵敏张晨何薇薇王潇潇杨永娟张中洋沈心亮李秀玲
- 关键词：肠病毒71型
- 建立膜抗原荧光抗体试验评价北京株冻干水痘疫苗免疫效果被引量：7
- 2005年
- 为了建立用于水痘疫苗接种后血清中特异性抗体检测的膜抗原荧光抗体(FAMA)法,并对接种水痘疫苗后儿童血清中水痘特异性抗体进行检测,评价北京株水痘疫苗的免疫效果。以水痘带状疱疹病毒(VZV)感染细胞作为抗原制备成固定抗原玻片,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG作为二抗建立FAMA法,并对该法的敏感性、特异性进行验证。运用此法对不同剂量北京株水痘疫苗接种后儿童血清中特异性抗体进行检测,分析儿童血清中水痘特异性抗体水平以及免后抗体阳转率,并与Oka株水痘疫苗进行比较。结果显示,FAMA法敏感性可达0.0196IU/ml,特异性好。应用此法检测300名观察者免前免后双份血清样本中抗VZVIgG,易感者中北京株水痘疫苗原苗(39810PFU/0.5ml)、2000PFU/0.5ml、500PFU/0.5ml接种组儿童血清免后抗体阳转率分别为100%、98.77%、85.42%,抗体几何平均滴度(GMT)分别为36.4、34.3、18.6,原苗与2000PFU间的抗体阳转率和GMT均无显著性差异(P>0.05),但原苗与500PFU、2000PFU与500PFU间的抗体阳转率和GMT均有显著性差异(P<0.05)。对照国产、进口Oka株水痘疫苗接种后抗体阳转率分别为95.35%、96.97%,抗体GMT分别为13.3、16.0,不同剂量北京株疫苗抗体阳转率与国产、进口Oka株疫苗相比,差别无显著性(P>0.05),但北京株疫苗原?
- 谢云李秀玲刘立新何薇薇张中洋张晨宋衍燕陈海平周铁群
- 关键词：水痘疫苗免疫效果
- 人乳头瘤病毒16型L1/E7嵌合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达
- 2006年
- 目的 克隆人乳头状瘤病毒16型（HPV16）L1／E7嵌合蛋白基因，并在毕赤酵母中表达。方法 PCR扩增HPV16L1／E7基因，并克隆至毕赤酵母表达载体pPIC-3．5K和pPIC-9K中，构建含HPV16L1／E7基因的pPIC3．5K—HPV16L1／E7和pPIC9K—HPV16L1／E7重组表达载体，经测序证实插入的外源基因读码框正确后，分别转入GS115和KM71菌株中，筛选阳性转化菌株，经PCR鉴定，甲醇诱导表达HPV16L1／E7嵌合蛋白，经SDS—PAGE和Western blot鉴定，电镜观察，并经离心法纯化VLPs。结果 HPV16LI／E7基因已成功插入pPIC-3．5K和pPIC-9K载体中，共获得6株KM71HPV16L1／E7-pPIC3．5K、5铢GS115HPV16L1／E7-pPIC3．5K、1株KM71HPV16L1／E7-pPIC9K和2株GS115HPV16L1／E7-pPIC9K阳性转化菌株，并可表达相对分子质量约为69000的蛋白，与预期值一致。表达量约为0．35～1．04mg／ml。Western blot显示该蛋白可与抗-HPV16L1蛋白和抗-HPV16E7蛋白的单克隆抗体特异性结合。在透射电镜下可观察到VLPs的形成，其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。经纯化的目的蛋白纯度接近100％。结论 已成功构建了pPIC3．5K—HPV16L1／E7和pPIC9K—HPV16L1／E7重组表达载体，阳性转化菌株可表达结构与野生型HPV16一致的VLPs。
- 宋衍燕李秀玲何薇薇张中洋许丽锋
- 关键词：人乳头瘤病毒毕赤酵母基因表达
- 人巨细胞病毒gB基因真核表达载体在小鼠中的免疫效果被引量：5
- 2005年
- 目的观察人巨细胞病毒(HCMV)gB基因真核表达载体在小鼠中的免疫效果.方法大量提取目的质粒,分3个剂量组进行多点肌肉注射免疫小鼠,利用MTT法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,ELISA法检测小鼠血清中HCMV特异性抗体,中和试验检测小鼠血清中和抗体.结果 ELISA检测结果表明,与空白对照、空载体对照组相比,3个剂量组pcDNA3.1/gB质粒免疫后小鼠血浆中抗HCMV IgG抗体水平均明显增高(P＜0.05),中和抗体水平为1:20～1:40,而对照组血清中无中和抗体存在.淋巴细胞增殖指数免疫小鼠与正常小鼠差异无显著意义.结论已构建的HCMVgB基因真核表达载体可以诱导小鼠产生明显的体液免疫,为核酸疫苗研究奠定了基础.
- 张中洋李秀玲何薇薇
- 关键词：人巨细胞病毒GB基因真核表达载体小鼠免疫反应核酸疫苗
- 我国水痘-带状疱疹病毒VZV84-7减毒株基因特征研究被引量：3
- 2004年
- 目的 建立水痘 带状疱疹病毒 (VZV)毒株的特异性鉴定方法 ,研究我国分离的VZV84 7减毒株(VZV84 7株 )基因特征。方法 利用PCR分别扩增VZV84 7株和Oka株R2和R5可变区基因 ,比较两者串联重复单位拷贝数 ;用PCR结合限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)分析VZV84 7株和Oka株基因的BglI、PstI酶切位点突变 ;并对gpI编码区基因进行序列分析。结果 VZV84 7株R2、R5区PCR产物分别为 4 2 5bp和 2 5 5bp ,对应的串联重复单位拷贝数分别为 7和 1;Oka株R2、R5区PCR产物分别为 4 2 5bp和 36 7bp ,对应的串联重复单位拷贝数分别为 7和 2。VZV84 7株基因存在PstI酶切位点 ,而Oka株无PstI酶切位点 ;两者均存在BglI酶切位点。基因序列分析显示 ,VZV84 7株与Oka株在gpI区存在 4个碱基差异 ,并导致 1个编码氨基酸不同 ,氨基酸序列同源性为99 8%。结论 所建立的PCR和PCR RFLP方法简便、特异 ;VZV84 7株的基因特征与Oka株存在一定差异 。
- 李秀玲谢云何薇薇张中洋庞宇刘立新
- 关键词：水痘-带状疱疹病毒减毒株基因聚合酶链反应VZV
- 肠病毒71型分离株的鉴定及免疫原性研究被引量：1
- 2009年
- 目的在对肠病毒71型（enterovirus 71，EV71）分离株进行鉴定的基础上，对其诱导小鼠产生的免疫应答水平进行研究，拟为进一步的EV71候选疫苗研究奠定基础。方法超速离心纯化病毒后，采用磷钨酸负染法通过电镜观察病毒形态、大小；采用特异性EV71单抗通过间接免疫荧光法（IFA）检测病毒的特异性；合成EV71特异性引物，通过RT—PCR对病毒进行分子生物学鉴定；病毒的VP1基因序列测定后，与其他EV71序列进行比较，绘制种系发育树，确定病毒基因型；通过腹腔注射途径免疫小鼠，免疫后分离血清通过微量细胞病变抑制法测定血清中和抗体效价，ELISA法检测血清抗体水平和抗体亚型水平。结果电镜下可观察到典型的圆形病毒颗粒，直径为20～30nm，呈典型的肠病毒形态；085和087株病毒感染细胞中均能观察到黄绿色荧光，提示该两株病毒可与EV71单抗特异性结合；RT—PCR可以从病毒感染细胞中扩增出226bp大小的特异性产物带，而采用CA16特异性引物则不能扩增出相应大小的产物带；基于VP1基因序列的种系发育分析显示，087和085株均为c4基因型；085和087株E、EV71免疫小鼠后可诱导产生能中和包括其本身在内的多个病毒株的中和抗体，针对同一株中和病毒，实验组间差异无统计学意义；针对不同中和病毒株，各实验组中和本株、523-07T株的能力明显高于FY-02T株（P〈0．05）；ELISA法检测结果显示，接种灭活前后的EV71病毒085和087株后均能诱导小鼠产生抗EV71特异性IgG；IgG亚型为IgG1／IgG2a混合型，灭活病毒免疫组小鼠血清EV71特异性IgG、IgG1、IgG2a水平明显高于活病毒免疫组（P〈0．05）。两株病毒之间差异无统计学意义。结论本研究分离到的085和087株病毒均为EV71CA基因亚型，并具有一定的免疫原性。
- 李秀玲张中洋王潇潇杨永娟郝春生赵敏何薇薇张晨沈心亮
- 关键词：肠病毒71型免疫原性
