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重组凝血酶敏感蛋白-1N端片段对CD36表达阴性的ECV304细胞增殖的抑制: 2006年; 目的:构建凝血酶敏感蛋白-1N端片段(TSF)的原核表达体系,测定重组蛋白的活性。方法:从人脐静脉内皮细胞cDNA中扩增得到thbs1基因片段,克隆到pET32c(+)载体系统并转化 BL21大肠杆菌,表达纯化得到TSF。MTT法体外测定目的蛋白对ECV304细胞增殖的抑制作用。免疫荧光标记流式细胞仪测定CD36的表达。结果:获得了原核表达的重组TSF蛋白。目的蛋白对CD36阴性的ECV304细胞有增殖抑制作用。结论:低剂量重组TSF蛋白是一个具有临床应用前景的抗肿瘤治疗的辅助方法。; 王黎芳周毓玲顾洁韩忠朝; 关键词：表达纯化

水蛭素变异物1基因克隆与表达: 1999年; Haycraft于1884年发现医用水蛭提取物中有抗凝物质。50年代末,Mark-Warat首次分离出纯品,命名为水蛭素(Hirudin)。水蛭素是至今为止所发现的凝血酶最有效最特异的天然抑制剂。; 王荷碧郭娟蔡英林顾洁刘艳彤; 关键词：水蛭素抗凝物质分离纯化凝血酶静脉血栓

Tet2调节骨髓间充质干细胞功能被引量：1: 2019年; Tet2(Tet家族成员2)在DNA去甲基化修饰、表观遗传调控及骨髓造血中起着重要作用。笔者课题组前期研究发现,随着年龄增长,Tet2敲除小鼠逐步发展为淋系白血病和髓系白血病。但Tet2在骨髓微环境中的作用仍不清楚。进一步研究发现,Tet2敲除的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)更多处于G2/M分裂期,其细胞分裂时间缩短,生长速度加快。长周期培养-起始细胞实验表明,Tet2敲除的MSC支持造血干细胞扩增和髓系分化的能力增强。通过点杂交实验发现,Tet2敲除后,骨髓细胞DNA总甲基化水平升高。对Tet2缺失的骨髓细胞进行甲基化测序,结果表明:基因组转录调控区域等多个功能性结构域的甲基化水平明显升高。同时,敲除Tet2的MSC分泌IL-8、IL-18等炎性细胞因子的能力下降;敲除Tet2的MSC更多分泌促进造血干细胞髓系分化的GM-CSF和CCL-3等细胞因子。Tet2可以影响间充质干细胞造血支持作用,进而调节造血。; 顾洁王玉霞高娟袁胜男初雅婧李妍涵袁卫平汪晓敏; 关键词：表观遗传调控 DNA甲基化间充质干细胞

重组水蛭素克隆的表达及其产物的分离纯化被引量：7: 1998年; 目的：在原核细胞中表达具有生物活性的重组水蛭素变异物１（ｒＨＶ１）并进行重组产物的分离纯化研究。方法：以质粒ｐＢＶ２２０为载体，在大肠杆菌ＤＨ５α中表达ｒＨＶ１，发色底物法测定其抗凝血酶生物活性；利用超滤、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０以及凝血酶亲合层析进行重组产物的分离纯化。结果：在大肠杆菌中获得了ｒＨＶ１的活性表达，表达量约占总蛋白的１６．９％，活力达到２０～３０ＡＴＵ／ｍｌ培养液；初步的纯化研究得到了具抗凝生物活性的ｒＨＶ１纯品，ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一条带。结论：重组水蛭素变异物１的活性表达及其分离纯化研究填补了国内空白，为研制国产高效重组抗凝药物带来希望。; 郭娟王荷碧顾洁朱宏彦; 关键词：纯化水蛭素克隆

血小板第四因子在原核中的高效表达、分离纯化及活性测定: 2002年; 构建重组表达质粒pET - 32c PF4 ,并在原核中进行表达 ,以探讨其对白血病细胞系 (HEL)细胞增殖的作用。方法 :通过PCR方法从含有PF4基因的PQE - 6 0 PF4质粒中扩增PF4 ,用NcoⅠ HindⅢ双酶切 ,克隆到原核表达质粒pET - 32C中 ,使之在BL2 1表达 ,Ni-ChelatingSepharose亲和柱纯化 ,用细胞集落形成方法研究重组PF4对HEL的抑制作用。结果 :菌株筛选后在大肠杆菌中获得可溶性高效表达 ,重组PF4占菌体总蛋白的 2 2 %。肠激酶酶切除去N -端融合部分 ,获得了高纯度的重组人血小板第四因子 (rh -PF4 ) ,纯度为 95%以上。活性实验发现重组PF4可抑制HEL细胞集落的形成 ,抑制率为 4 7%。结论 :原核表达质粒pET - 32C可高效可溶性表达PF4 ,重组PF4对HEL细胞的增殖有抑制作用。; 顾洁刘拥军卢士红蔡英林刁世勇韩忠朝; 关键词：血小板第四因子原核分离纯化活性测定

血小板生成素改构体基因的克隆和序列分析: 2003年; 采用PCR技术 ,根据文献报道的鼠TPO成熟肽基因序列 ,设计并合成两对引物 ,以鼠TPOcDNA为模板 ,扩增获得mT PON端 15 3个氨基酸的 4 78bpcDNA片段及鼠TPO全长 10 32bpcDNA片段 ;mTPO15 3片段与合成的碱性成纤维生长因子序列中Lys119-Lys135aa的 5 1bp肝素结合位点DNA片段连接 ,克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序 ;同时将扩增的鼠TPO全长cDNA片段克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序 ,证明获得鼠血小板生成素与肝素结合位点基因及鼠TPO全长基因 ,继之以pMAL -C2X为表达载体构建表达质粒。; 李彬蔡英林韩忠朝郭娟顾洁刘澎; 关键词：血小板生成素基因克隆碱性成纤维生长因子

内皮和造血系统特异性敲除Rictor基因对胎肝造血的影响被引量：1: 2014年; 目的:研究Rictor基因对胚胎发育过程中胎肝造血的影响。方法:利用Cre-LoxP基因敲除系统,特异性在小鼠内皮(VEC-Cre)和造血(Vav1-Cre)系统敲除Rictor基因;通过流式细胞术分析特异敲除Rictor基因后小鼠胚胎第15 d胎肝中的各系细胞比例的变化,并进一步分析造血干细胞的变化。结果:利用VEC-Cre和Vav1-Cre小鼠敲除Rictor基因后,胎肝中各系细胞比例均有所减少,B细胞比例的减少较为明显,造血干细胞比例也明显减少。结论:Rictor基因敲除损害胎肝组织中造血干细胞的产生和各系细胞的分化。; 穆晓环王伟丽赵云泽倪艳丽李专顾洁张丽艳汪晓敏程涛刘汉芝袁卫平刘兵; 关键词：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

国产苯扎贝特对高三酰甘油血症脂代谢及糖代谢影响的研究被引量：13: 2009年; 目的研究国产苯扎贝特与非诺贝特对中老年高三酰甘油(TG)血症患者脂代谢及糖代谢的影响。方法收集2006年5月至2007年7月在解放军总医院门诊、住院142例患者,随机入选苯扎贝特组(苯组)、非诺贝特组(非组)和空白对照组(对照组),分别接受每日600 mg苯扎贝特、300 mg非诺贝特或作为空白对照,疗程3个月。对比各组治疗前后及3组间脂代谢指标:总胆固醇(TC),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),TG;糖代谢指标:空腹血糖(FBG),餐后2 h血糖(2 h PBG),空腹胰岛素(F-INS);胰岛素抵抗指数(IRI);糖耐量异常发病率(IGTR)的变化。结果脂代谢:治疗后,苯组、非组的TC、LDL-C、TG均显著降低,HDL升高(P均<0.01)。治疗后3组间比较,苯组TC、LDL-C、TG均低于对照组(P<0.05,P<0.01,P<0.01),HDL-C高于对照组(P<0.05);非组LDL-C、TG低于对照组(P<0.05,P<0.01),TC差异无统计学意义(P>0.05),HDL-C高于对照组(P<0.05)。两治疗组比较,各项血脂指标差异均无统计学意义(P>0.05)。糖代谢:治疗后,苯组、非组、对照组IGTR下降62.1%(P<0.05),20.0%(P>0.05),0(P>0.05);治疗后3组IGTR存在差异(P<0.05),苯组显著低于对照组和非组(P<0.025)。治疗后,苯组FBG无显著变化(P>0.05),2 h PBG、F-INS、IRI均下降(P<0.01);非组FBG无显著变化(P>0.05),2 h PBG、F-INS、IRI均降低(P<0.05)。治疗后3组间比较,FBG差异无统计学意义(P>0.05);苯组2 h PBG、F-INS、IRI均低于对照组(P<0.01);非组F-INS、IRI低于对照组(P<0.05),2 h PBG虽低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);治疗后的两药物组比较,苯组2 h PBG、F-INS、IRI均低于非组,2 h PBG、F-INS的差异具有统计学意义(P<0.05),IRI差异无统计学意义(P>0.05)。结论国产苯扎贝特和非诺贝特不仅具有肯定的、相似的调脂作用,而且还具有不同程度改善糖代谢的作用,其中,国产苯扎贝特的作用更显著。; 骆雷鸣朱启伟朱兵李妍涵顾洁李溪远马琴曾强杨雪吴红梅毛利叶平; 关键词：降血脂药脂代谢糖代谢

人凝血酶敏感蛋白1抗血管生成活性片段重组腺病毒高效制备被引量：3: 2003年; 目的构建人凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1,TSP1)抗血管生成片段重组腺病毒。方法采用RT-PCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增编码TSP1抗血管生成活性片段(TSP1f)的cDNA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV上,以线性化重组穿梭载体与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组并酶切鉴定筛选正确重组子,用线性化重组质粒转染人胚肾293细胞,制备重组腺病毒ADV-TSP1f,最后以PCR及Westernblot方法鉴定TSP1抗血管生成片段的表达。结果细菌内同源重组共获得43个卡那霉素抗性克隆,经酶切鉴定表明其中直径最小的10个均为正确重组子,该重组质粒转染293细胞所获得的重组腺病毒可高效表达TSP1抗血管生成片段,纯化后病毒滴度为1.0×1011pfu/mL。结论细菌内同源重组法构建重组腺病毒高效快捷,所获得的ADV-TSP1f可进一步应用于抗肿瘤血管生成的基因治疗研究。; 刘澎王一杨仁池顾洁蔡英林韩忠朝; 关键词：腺病毒

抗肿瘤的PF4及相关肽基因重组腺病毒的构建: 2003年; 利用细菌内同源重组法构建含PF4(血小板第四因子)全长1-70及PF4的小肽17-70基因的重组腺病毒。方法:将连有MCP-1信号肽的PF4全长及其C末端的改构体PF4-17-70两个基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒pAdshuttle-CMV中,形成转移质粒pAdshuttle/PF4(1-70)和pAdshuttle/PF4(17-70),将之酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提并鉴定含目的基因的重组体质粒,而后用磷酸钙共沉淀方法转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒AdPF4(1-70)和AdPF4(17-70)。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,扩增并纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度,利用带有CMV-LacZ的对照重组腺病毒(Ad-LacZ)对感染效率进行监测。结果:利用电穿孔法分别将质粒pAdshuttle/PF4(1-70),pAdshuttle/PF4(17-70)与质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得70%以上的阳性重组体细菌克隆。PCR检测结果表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1×1010pfu/ml。结论:利用细菌内同源重组法可以简便、快捷地构建含PF4(1-70)、PF4(17-70)cDNA的腺病毒载体,为两者在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。; 吴立华刁世勇蔡英林顾洁任倩李彬杨仁池韩忠朝; 关键词：腺病毒 PF4 同源重组细菌肿瘤

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顾洁

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