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arcA基因提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性被引量：1: 2016年; 【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以P.putida JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b(+)连接后导入E.coli JM109(DE3)中,验证该基因提高E.coli JM109(DE3)对有机溶剂的耐受性。利用Red同源重组的方法将arc A整合到E.coli JM109(DE3)基因组中。【结果】E.coli JM109(DE3)/p ET-20b(+)-arc A在添加了2.0%(体积比)环己烷、0.1%(体积比)甲苯、4.0%(体积比)萘烷和0.1%(体积比)丁醇的培养基中培养8 h后,其OD660由初始的0.2分别上升到0.8、0.9、1.8和1.3。将arc A成功整合到E.coli JM109(DE3)基因组中,获得了具有较好遗传稳定性的溶剂耐受E.coli JM109(DE3)宿主菌株。【结论】外源基因arc A能提高大肠杆菌菌株的有机溶剂耐受性,为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。; 张法韩瑞枝许国超董晋军倪晔; 关键词：精氨酸脱亚胺酶 RED同源重组有机溶剂耐受性恶臭假单胞菌大肠杆菌

碱预处理秸秆同步糖化发酵生产丁二酸被引量：5: 2011年; 研究了碱预处理秸秆及用琥珀酸放线杆菌Actinobacillus sucinogenes同步糖化发酵秸秆生产丁二酸。结果表明:用1.0%NaOH溶液于120℃分别预处理玉米、小麦和水稻3种秸秆2 h,其木质素的脱除率、纤维素与半纤维素的总保留率均在85%以上。以3种碱预处理后的秸秆为原料,在补加纤维素酶与纤维二糖酶的条件下,A.sucinogenes F3-21摇瓶厌氧发酵72 h,产丁二酸浓度分别为30.74 g/L、24.98 g/L和26.57 g/L;在7 L罐中厌氧发酵72 h,丁二酸浓度分别达到40.21 g/L,30.06 g/L和39.07 g/L,每克预处理秸秆产丁二酸分别为0.50g、0.38 g和0.49 g。并用钙盐法对玉米秸秆同步糖化发酵液进行提取,得到纯度为99.98%的丁二酸结晶。说明了玉米、小麦和水稻3种秸杆为原料进行同步糖化发酵生产丁二酸的可行性。; 孔德城郑璞董晋军倪晔孙志浩; 关键词：秸秆丁二酸同步糖化发酵

糖基转移酶UGT73C5在大肠杆菌中的可溶性表达研究被引量：1: 2023年; 络塞是一种抗高原反应药物的主要活性成分,可通过尿苷二磷酸糖基转移酶UGT73C5催化肉桂醇糖基化反应合成。然而UGT73C5在大肠杆菌宿主中可溶性表达极差,严重限制了其工业应用。该研究分别通过与分子伴侣共表达和与助溶蛋白标签融合表达的方式,提高UGT73C5在Escherichia coli BL21(DE3)中的可溶性表达。结果显示,除质粒pKJE7外,与分子伴侣质粒pG-KJE8、pGro7和pG-TF2共表达后均可提高UGT73C5酶活力,分别为原始酶活力(18.56 U/g细胞)的1.27、1.18、1.37倍。此外,利用硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)和谷胱甘肽巯基转移蛋白(glutathione S-transferase,GST)两种助溶蛋白标签,构建的融合酶Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5的酶活力为原始酶活力的1.45、2.54倍,且纯化后的比酶活力为原始酶的80%~90%。最后,在2 mmol/L肉桂醇合成络塞的反应中,相同浓度细胞破碎液(粗酶)融合酶GST-UGT73C5比原始酶催化效率更高,4 h后转化率可以达到90%以上,最终转化率达到93.6%。因此,助溶蛋白标签融合表达法可有效提高UGT73C5在大肠杆菌中的可溶性表达,且融合酶GST-UGT73C5在络塞的酶法合成中具有更大的应用潜力。; 方红辉倪晔周婕妤董晋军许国超张兆俊韩瑞枝; 关键词：糖基转移酶可溶性表达分子伴侣肉桂醇

菊芋原料同步糖化发酵生产丁二酸被引量：13: 2008年; 对菊芋原料发酵生产丁二酸进行了研究,用Actinobacillus succinogenes和Aspergillusniger同步糖化发酵,发现同步糖化发酵效果优于糖化后再发酵,在同步糖化发酵过程中还原糖质量浓度始终保持在10～40 g/L,可以避免高浓度的还原糖对A.succinogenes的抑制。5 L搅拌罐中同步糖化补料分批发酵96 h产丁二酸98.2 g/L,对消耗糖产率95.4%,生产强度1.02g/（L.h）。; 董晋军郑璞倪晔孙志浩; 关键词：丁二酸菊芋同步糖化发酵 ACTINOBACILLUS NIGER

碳酸盐对谷氨酸产生菌在缺氧条件下产有机酸的影响被引量：4: 2011年; 考察谷氨酸产生菌在缺氧条件下积累L-乳酸和琥珀酸的情况。结果表明:在缺氧条件下,嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870积累有机酸的浓度随菌体密度的增大而增加,其中琥珀酸和乳酸积累的最适pH分别为7.5和8.0,最高质量浓度分别为22.5和60 g/L。碳酸盐是影响产酸与有机酸分布的主要因素。比较ATCC 13870在NaHCO3浓度为40和400 mmol/L时的代谢通量,发现后者合成琥珀酸的代谢通量比前者提高了214.1%,合成乳酸的代谢通量降低了61.8%,说明PEP节点处的代谢通量分配明显受NaHCO3浓度的影响,而PYR节点受环境因素的影响不明显。; 于芳郑璞倪晔董晋军王兴林孙志浩; 关键词：谷氨酸产生菌乳酸代谢流缺氧琥珀酸

利用甘蔗糖蜜半连续发酵生产琥珀酸被引量：14: 2008年; In this work, the semi-continuous succinic acid fermentation by Actinobacillus succinogenes CGMCC1593 from cane molasses with a novel two-stage and two-stream system was studied, in order to increase the succinic acid productivity.The fermentation conditions of the first stage, such as initial sugar concentration, medium addition volume, and time interval of each loading were optimized.Under the optimized condition the maximum succinic acid productivity (2.38 g·L-1·h-1) was increased by 111% and 114% compared with those obtained in batch and fed batch fermentation, respectively.In addition, the maximum succinic acid concentration (46.0 g·L-1)increased by 12.9% compared with that in batch fermentation, and reached a compatible level of that obtained in fed batch fermentation (36 h, 48.8 g·L-1).This process was operated stably for 39 circles without any decreases in both succinic acid concentration and productivity.During the 39 operation circles, the fermentation time of each batch (stage 1 and stage 2), the average succinic acid concentration, succinic acid productivity, succinic acid yield, and sugar conversion rate were 21—24 h, 43.5 g·L-1, 2.07 g·L-1·h-1, 0.79 g·g-1, and 96.4%, respectively.; 董晋军郑璞孙志浩倪晔刘宇鹏; 关键词：琥珀酸甘蔗糖蜜半连续发酵 ACTINOBACILLUS

高产琥珀酸菌株的通量筛选: 2012年; 摘以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes F3-21为出发菌株,分别用吖啶黄、紫外线、紫外线-硫酸二乙酯和亚硝基胍进行诱变,产生突变菌库。用"96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛"的模式筛选高产突变株。从1056株突变株中,筛选到一株高产菌株Ⅵ-10-C。连续传代10次,产酸水平不变。在5 L发酵罐中补料分批发酵72 h,Ⅵ-10-C产琥珀酸87.6 g/L,生产强度1.22 g/(L·h),糖酸转化率0.66g/g;琥珀酸产量比出发菌提高了30%。代谢通量与关键酶活性分析表明:相比于F3-21,Ⅵ-10-C发酵过程中从磷酸烯醇式丙酮酸节点处流向草酰乙酸的代谢流量增加了28.9%,相对应的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)酶活提高了23.5%。结果表明用"96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛"的模式能快速有效筛选高产琥珀酸菌株。; 张坤坤郑璞董晋军于芳倪晔孙志浩; 关键词：琥珀酸

秸秆碱预处理液脱毒及其在丁醇发酵中的应用: 2020年; 秸秆的碱预处理液可造成严重的环境污染。该研究基于源头控制的理念,对碱预处理液进行脱毒工艺研究并回收进行丁醇发酵研究。通过加酸去除碱预处理液中的木质素,用活性炭将去除木质素的预处理液脱毒并用于水解和发酵过程。优化获得沉淀碱溶性木质素的最佳pH 3.8;不同加量活性炭脱毒后的碱预处理液对秸秆水解的影响不明显,然而活性炭的添加量对丁醇发酵影响较大,当活性炭添加量为15 g/L时,发酵72 h达到最高丁醇质量浓度10.2 g/L。该秸秆碱预处理液脱毒工艺对利用秸秆进行无废生产生物燃料有一定参考价值。; 董晋军马宝剑龚磊韩瑞枝许国超周婕妤倪晔; 关键词：玉米秸秆木质素脱毒丁醇

谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较被引量：5: 2019年; 【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(CorynebacteriumglutamicumATCC13032)基因组上的argR和argF基因进行敲除,比较两种敲除方法的优缺点,为合理选择敲除系统提供依据。【方法】特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kanR片段,然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应,从而去除替换到基因组上的kanR片段,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除。CRISPR-Cpf1敲除系统是利用Cpf1对pre-crRNA进行加工,形成的成熟crRNA引导Cpf1识别和结合到靶DNA的特定序列上并切割双链DNA分子,通过同源重组作用去除靶基因,基于质粒自身的温敏特性将其消除,从而完成基因敲除的整个过程。【结果】Cre/lox P系统可在8N+2 d内完成N轮迭代基因敲除,而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2d内完成N轮迭代基因无痕敲除,理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑,效率更高,但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点。【结论】与Cre/loxP系统相比,CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除,理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高,然而编辑效率还有提高的空间。; 占米林阚宝军张辉董晋军许国超韩瑞枝倪晔; 关键词：谷氨酸棒状杆菌同源重组基因敲除

基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌被引量：9: 2009年; 以琥珀酸产生菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593为出发菌，分别经过紫外线一甲基磺酸乙酯（UV—EMS）和紫外线一硫酸二乙酯（UV—DES）诱变处理，得到7株耐酸性有所提高的突变株。以此作为候选菌库，经3轮原生质体递进融合，筛选获得4株可以在pH5．6下生长的改组菌株。其中改组菌株F3．21在pH5．6的完全液体培养基中生长的OD值是原始菌的7倍，在pH5．2条件下仍能生长；其摇瓶发酵48h琥珀酸产量较原始菌株提高48％。在5L发酵罐中进行分批发酵，当控制pH在较低值（5．6～6．0）时，F3—21厌氧发酵48h积累琥珀酸38．1g／L，较出发菌株提高了45％：当控制pH在6．5～7．0时，F3—21厌氧发酵32h积累琥珀酸40．7g／L。F3—21在5L发酵罐中进行补料分批发酵，厌氧发酵72h，产琥珀酸达67．4g／L。结果说明基因组改组技术能够改进琥珀酸放线菌的耐酸性能及其琥珀酸的产量。; 刘璇郑璞倪晔董晋军孙志浩; 关键词：基因组改组耐酸性琥珀酸

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董晋军

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