- 从人源全合成抗体库中筛选到抗人干扰素α1b单链抗体被引量：4
- 2009年
- 目的研究开发人源抗huIFN-α的基因工程抗体,为系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)的治疗提供有效的抗体药物。方法本研究利用噬菌体表面展示技术,以纯化的人干扰素α1b(huIFN-α1b)和人干扰素α2b(huIFN-α2b)蛋白为抗原从人源全合成抗体库中筛选抗huIFN-α的基因工程单链(single chain variable fragment,scFv)抗体,通过phage-ELISA对噬菌体单链抗体的结合特异性和稳定性进行验证。将单链抗体基因克隆到原核分泌表达载体pET22b上在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过Westernblot检测单链抗体的分泌表达,并通过ELISA对单链抗体的结合特异性进行验证。通过金属螯合亲和层析纯化单链抗体,并用WesternBlot对单链抗体的结合特异性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,获得100株对huIFN-α1b有特异性结合的噬菌体单链抗体。对得到的86株克隆的测序分析表明,共有9株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体,有7株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL3家族,有2株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL1家族。获得了5株稳定且特异针对huIFN-α1b而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源单抗。这5株抗体在BL21(DE3)中分泌表达,有3株单链抗体能特异性结合huIFN-α1b而与无关抗原无交叉反应。结论通过噬菌体表面展示技术,从人源全合成抗体库中筛选得到3株稳定且特异结合huIFN-α1b的人源治疗用基因工程单克隆抗体。
- 龚斌王双李川王颖张全福陈哲孙丽娜梁米芳孙志伟李德新
- 关键词：干扰素I型单克隆
- 人源抗人干扰素hulFN-α1b基因工程抗体的筛选与研究
- 系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种严重威胁人类健康的自身免疫疾病,研究表明人干扰素α (huIFN-α)与该疾病的发生有密切关系,这使其成为SLE临床治疗中重要的靶点...
- 龚斌
- 关键词：噬菌体表面展示人源基因工程抗体
- 文献传递
- 人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定
- 2012年
- 目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光（IFA）和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光（IFA）鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体蛋白。
- 龚斌李川梁米芳
- 关键词：纯化
- 大容量抗体库高通量筛选方法的研究进展
- 2009年
- 随着蛋白质组学研究的发展，抗体在疾病的诊断、治疗和基础研究上的作用越来越大，迫切要求发展高通量的抗体筛选方法。本文研究整理了最近几年在噬菌体抗体高通量筛选方法上的研究进展，对磁珠法、基于自动化工作站的普通ELISA法、膜法、微阵列芯片法和液相悬浮芯片法等高通量筛选方法进行了综述。
- 龚斌梁米芳李德新
- 关键词：高通量抗体库选方微阵列芯片ELISA法噬菌体抗体
- 全人源抗人干扰素α1b基因工程抗体与抗原的结合表位鉴定
- 2012年
- 目的鉴定抗原人干扰素α1b(huIFN-α1b)与1株全人源抗体蛋白AIFNa1IgG1的结合表位。方法从正常人分离纯化淋巴细胞并抽提mRNA进行CDNA合成,以CDNA为模板通过PCR扩增得到huIFN-α1b基因,通过重叠延伸PCR法构建huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸残基缺失突变体及点突变体,野生型和突变基因与载体pET30a连接构建重组表达载体,将以上重组表达载体转化大肠杆菌表达宿主E.coli Rosseta(DE3),诱导表达后的huIFN-α1b蛋白及突变体通过Western blot分析其与全人源抗huIFN-α1b基因工程抗体蛋白的结合活性。结果 huIFN-α1b蛋白在E.coli Rosseta(DE3)细胞中成功表达,Western-blot分析表明野生型huIFN-α1b蛋白与抗体结合,29-35位氨基酸缺失与抗体失去结合活性,其中27位的Ser,33位的Asp,34位的Arg,35的His,36位的Asp突变为Gly后,抗体与huIFN-α1b的结合可减弱到不可检测的水平。结论 huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸形成的表位是与抗体AIFNa1IgG1结合的重要表位。
- 龚斌梁米芳
- 关键词：抗体表位重叠延伸PCR
